Replicación, Recombinación, Mutación y Reparación del DNA

Tema 16, Replicación, Recombinación, Mutación y Reparación del DNA
Para dar a cada célula hija la misma información se ha de duplicar el DNA, este proceso de denomina replicación. Existe un amplio sistema enzimático que controla este proceso y vela porque se lleve a cabo correctamente.
Cada cadena actúa de molde para la síntesis de una nueva cadena. Es semiconservativa.
Meselson y Stahl cultivaron cel de E. coli durante varias generaciones en un medio con 15N, después sometieron el DNA aislado de este cultivo a un gradiente de CsCl y obtuvieron que pesaba un 1% más que el DNA normal.
Células de E coli cultivadas en medio con 15N fueron transferidas a un medio que contenía 14N, donde se las dejó crecer hasta la duplicación de la polación. Formó una única banda en el gradiente de cloruro de cesio en una posición que indicaba que los DNA eran híbridos. La hipótesis se confirmó cuando se permitió que las células volviesen a doblar su nº. El DNA aislado de este segundo ciclo mostró dos bandas una con la densidad del DNA ligero y otra con la del híbrido.
Cairns mediante autorradiografía proporcionó la primera indicación de que la replicación era un proceso coordinado. Incorporó radioactividad en el DNA de E coli cultivando las células en un medio que contenía timidina marcada con tritio 3H. El DNA radioactivo de las células en replicación mostraba un bucle extra, resultado de la formación de dos cadenas hijas radiactivas, cada una complementaria de una cadena principal. Las dos cadenas se replican simultáneamente, es bidireccional.
Los bucles de replicación se inician en un punto único denominado origen. En el DNA circular, las dos horquillas de replicación vuelven a encontrase en el lado opuesto al origen.
Las cadenas de DNA siempre son sintetizadas en la dirección 5’3’, siendo el 3’OH libre el punto de elongación del DNA. Debido a que son antiparalelas, la cadena que actúa de molde es leída del extremo 3’ al 5’. Okazaki descubrió que una de las cadenas nuevas de DNA se sintetiza en forma de trozos cortos, fragmentos de Okazaki. La cadena contínua o conductora es aquella sintetizada en dirección 5’3’ la misma que va la horquilla y la cadena rezagada es la sintetizada en 3’5’ opuesta a la horquilla. Los fragmentos se unen mediante la DNA ligasa.
DNA polimerasa:
Duplica el DNA, requiere un molde, la reacción está dirigida por una cadena molde de DNA según las reglas de apareamiento. Es necesario un cebador, segmento de cadena con un grupo 3’-hidroxilo al cual pueden añadirse nucleótidos. El extremo 3’ del cebador se denomina extremo cebador. Las polimeraras de DNA sólo son capaces de añadir nucleótidos a una cadena preexistente, por ello estos son de RNA porque la RNA pol si que puede empezar a codificar sin un cebador.
Una vez acabada la polimerización, obtendremos un fragmento de RNA llamado primer, con uno de DNA. Posteriormente, el DNA sufrirá una maduración en la que se eliminarán los cebadores.
Después de añadir un nucleótido a una cadena creciente de DNA, la DNA pol se disocia o se traslada a lo largo del molde y añade otro nucleótido. El proceso es más rápido si la pol añade nucleótidos sin disociarse. El nº de nucleótidos añadidos antes de una disociación es su procesividad. Cuanto mayor sea, mayor efectividad y mayor será la velocidad.
 La DNA polimerasa I, realiza multitud de funciones de limpieza durante la replicación, la recombinación y la reparación. Funciones potenciadas por su actividad exonucleasa 5’3’ mientras que la 3’5’ lleva a cabo la corrección de pruebas, la actividad exonucleasa 5’3’ es capaz de reemplazar un segmento de DNA o RNA apareado a la hebra molde en un proceso de traslado. Esta función se localiza en el fragmento de Klendw. Tenemos 2 actividades pol:
► La exonucleasa 3’5’ elimina nucleótidos que no aparean bien con la hebra molde. Comprueba si los apareamientos son correctos, mediante 2 centros activos, uno polimeriza y otro relee lo que se ha sintetizado. SI se incorpora un nucleótido que no está apareado se crea el enlace fosfodiéster, pero cuando se comprueba, se detecta el apareamiento incorrecto y la actividad se detiene para corregir el error, se repara hidrolizando el enlace fosfodiéster con el centro activo de exonucleasa y se incorpora un nucleótido correcto.
►La exonucleasa 5’3’ se añade a una muestra de DNA y comienza a eliminar nucleótidos que están mal al mismo tiempo que va añadiendo los oligonucleótidos que están mal al mismo tiempo que va añadiendo los oligonucleótidos correspondiente lo que se hace es trasladar el fragmentso unos 10 nucleótidos más adelante. Sirve para reemplazar los cebadores de RNA.
 La DNA pol II, no es muy conocida.
 La DNA pol III, similar a la I y en E coli recibe el nombre de DNA replicasa. Tiene 10 subunidades, cada una con una actividad diferente; la actividad polimerasa se encuentra en la subunidad α y la exonucleasa únicamente exonucleasa 3’5’, en las subunidad θ, es la correctora de pruebas. Tiene mayor procesividad que la del tipo I gracias a las subunidades β, que impiden la disociación.
La replicación del DNA requiere muchas enzimas, al conjunto se denomina Sistema DNA Replicasa o Replisoma y se compone por:► Helicasas separan las hebras utilizando la energía química del ATP.
► Proteínas fijadoras de unión al DNA, estabilizan las hebras e impiden que se vuelvan a unir.
► Topoisomerasas alivian las tensiones topológicas creadas por el desenrollamiento de las cadenas.
► DNA Ligasas unen los fragmentos de DNA sintetizados y actúan de distinta forma dependiendo de si están en E coli o en otro organismo. Requieren energía para unir los fragmentos de DNA, excepto en E coli donde se requiere NAD.
REPLICACIÓN DEL DNA
Se lleva a cabo en 3 procesos continuos.
Iniciación:

En E coli sólo hay un punto de inicio, el oriC, una secuencia de 245p.bases con una serie de 3 repeticiones cortas con13p.b. y otra de repeticiones no consecutivas con 9pb. Tienen secuencias consenso, secuencias que se repiten en la misma posición en todas las especies, se obtienen de la comparación de E coli con otras bacterias.
Es la proteína DNAA, un complejo formado por unas 20 moléculas de proteína DNAA se une a las cuatro repeticiones de 9pb en el origen a continuación reconoce y sucesivamente desnaturaliza el DNA en la región de las repeticiones de 13pb ricas en A=T y que empiezan por la secuencia GATC. Este proceso requiere ATP y la proteína bacteriana HU, del tipo de las histonas. A continuación la DNAB se une a esta región. Dos exámenes de DNAB, uno en cada hebra actúan de heliclasa, desenrollando el DNA de manera bidireccional y creando dos horquillas de replicación potenciales. Muchas moléculas de SSB se fijan de manera cooperativa al DNA de cadena sencilla, estabilizando las cadenas separadas e impidiendo su Renaturalización, mientras que la ligasa alivia la tensión topolígica creada por la DNAB heliclasa.
Elongación
Consiste en dos operaciones relacionadas, la síntesis de la cadena conductora y la síntesis de la cadena rezagada. En ambas cadenas son importantes varias enzimas que se encuentran en la horquilla de replicación como polimerasas, primasas heliclasas y topoisomerasas.
La síntesis de la cadena conductora empieza con la síntesis de un cebador corto de RNA por la primasa en el origen. A continuación la DNA pol III adiciona desoxirribonucleótidos a este cebador. Una vez iniciada la síntesis transcurre de manera contínuo.
 La síntesis de la cadena rezagada se realiza a trozos y en sentido contrario a la apertura de la horquilla. Primero, un cebador es sintetizado por la primasa y la DNA pol III añade los desoxinucleótidos.
Ambas hebras son producidas por un dímero asimétrico de NA pol III. Para ello la hebra rezagada forma un bucle y aproxima los dos puntos de polimerización.
La heliclasa DNAB y la primasa DNAH constituyen una unidad funcional dentro del complejo de replicación, denominado Primosoma. Un juego de subunidades núcleo de la DNApol II circula entre un fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el bucle formado por la hebra rezagada. Para cada fragmento de Okazaki un cebador que después será sustituido por DNA por la polimerasa I y se unirán gracias a la DNA ligasa.
Terminación
Las dos horquillas de replicación del cromosoma circular se encuentran en una región terminal que contiene múltiples copias de una secuencia de 20pb denominada Ter, actúan como una especie de trampa donde una horquilla puede entrar pero no salir. Dependiendo del sentido actúan unas u otras, en el sentido horario: Ter c, Ter b, Ter F o Ter g, en el sentido antihorario: Ter h, Ter b y Ter d. Las secuencias de terminación son polares porque no hay señal que sirva para ambos sentidos, cada secuencia es específica. Las secuencias Ter son lugares de unión para una proteína denominada Tus. El complejo tus-ter puede detener la replicación, el primero con que topa una horquilla. La otra se detiene cuando encuentra a la primera.
El resultado son dos cromosomas circulares ligados en el espacio, catenados. La separación requiere topoisomerasa IV.
Características de la Replicación en Eucariotas.
Se han identitificado en eucariotas orígenes de replicación, replicadores. Los de levadura abarcan unos 150pb y contienen varias secuencias esenciales conservadoras. En todas los eucariotas, la iniciación necesita de un complejo proteico de múltiples subunidades, el complejo de reconocimiento del origen ORC, que se une a varias secuencias dentro del replicador. El ORC interacciona y es regulado por diversas proteínas implicadas en el control del ciclo celular.
La velocidad de la horquilla de replicación de los cromosomas tiene lugar bidireccionalmente a partir de múltiples orígenes situados entre 30.000 y 300.000 pb uno del otro. Aparecen los replicones, segmentos de pb alrededor de un origen. La actividad de estos se inicia con la producción de los cebadores. Los fragmentos de Okazaki son más cortos.
Actúan varios tipos de DNA pol, todas en el núcleo excepto la de tipo γ, encargada de replicar el DNA mitocondrial. En la replicación de los cromosomas nucleares interviene la DNA pol α, en asociación con la DNa pol δ. La DNA pol α está formada por múltiples subunidades, una de las cuáles tiene actividad primasa y la mayor contiene actividad de polimerización, carece de actividad 3’5’ y probablemente actúe en la síntesis de los cebadores de los fragmentos de okazaki. Estos cebadores alargados por la DNA pol δ. Asociada con la proteína PCNA, que la estimula. La PCNA forma una abrazadera circular que potencia la procesividad de la enzima.
La DNA pol E puede reemplazar a la δ y actuar en la horquilla de replicación.
En la replicación también actúan otros complejos proteicos. La RPA es una proteína de unión a DNa de cadena sencilla equivalente a la SSB. La RFC es necesaria para la unión del PCNA y facilita la formación de complejos de replicación activos.

La terminación de la replicación de los cromosomas lineales incluye la síntesis
De telómeros, en los extremos del cromosoma, tienen una longitud de entre 1 y 12kb formados por secuencias de 6-8pb que se repiten como máximo 4 veces. Normalmente la hebra TG es más larga que la CA y se forman extremos cohesivos. El extremo TG es rico en guanina y el final del telómero adquiere una estructura de lazos, lazos T, estructuras internas en la hebra CA.
En las hebras retrasadas la polimerasa no puede interaccionar en el extremo 5’ porque no puede eliminar el cebador. Por ello, en cada ciclo celular el telómero se acorta. La longitud de los telómeros está relacionada con el envejecimiento celular. Aunque también existen las telomerasas que elongan, están compuestas por RNA y proteínas. La parte de RNA es rica en C y funciona como complementario del extremo 3’ del telómero para unirse y elongarlo. La telomerasa añade una secuencia de 6 nucleótidos al 3’. Sin embargo con el tiempo dejan de actuar de forma correcta.
Recombinación
Intercambio o movimiento de secuencias dentro del DNA; proceso que ha permitido el cambio de caracteres en un organismo los procesos, se dividen en tres clases:
La recombinación homóloga, intercambio genético entre dos moléculas de DNA que comportan una región de secuencia casi idéntica.
 La recombinación específica de sitio, los intercambios sólo tienen lugar en una secuencia de DNA particular.
 La transposición normalmente interviene un segmento corto, con capacidad de trasladarse de un lugar. Son genes saltarines.
 Recombinación homóloga: En bacterias es un proceso de reparación del DNA, en eucariotas está asociado a la división celular y a la reparación del DNA. Según el modelo de Holiday, dos secuencias homólogas tienen que aproximarse y alinearse, luego se produce una rotura sencilla, en una sola hebra, y un entrecruzamiento entre las hebras cortadas, es el llamado intermediario de Holliday. Después, la DNA ligasa une los segmentos.
A continuación, el punto en el que tenemos las moléculas de DNA unidas va a migrar a través de las secuencias y transmitir información de unas a otras. Después se produce una isomerización en ela que la molécula gira y cortes transversales que no producen recombinación y forman un heterodúplex y longitudinales que si producen recombinación. Para finalizar el proceso la DNA polimerasa repararía cualquier hueco y la DNA ligasa unirá los cortes.
Recombinación específica de Sitio.
Tienen lugar en todas las células pero sus funciones varían según la especie, entre ellas está: la regulación de la expresión de ciertos genes o la promoción de reordenamientos programados, o en los ciclos de replicación de algunos virus y plásmidos. Todos consisten en una enzima denominada recombinasa y una
Secuencia única de DNA corta sobre la que actúa la recombinasa. Reconoce y se fija
A cada uno de los dos sitios de recombinación en dos moléculas diferentes de DNA. En cada sitio se corta una cadena de DNA en un punto específico, la recombinasa queda unida covalentemente al DNA en el sitio de corte mediante un enlace fosfotirorina. Las hebras de DNA cortadas se unen a nuevas hebras formando un intermedio de Holliday con nuevos enlaces fosfodiéster, creados a expensas de la unión proteína-DNA. Para completar la reacción el proceso se ha de repetir en un segundo punto dentro de cada uno de los dos sitios de recombinación. El intercambio es siempre reciproco y preciso. Los sitios de recombinación son generados una vez completada la reacción. La recombinasa puede considerarse a la vez como una nucleasa específica de sitio y una ligasa. Si los dos sitios recombinantes están en la misma molécula, la reacción da lugar a la delección o a la inversión del DNA limitado por ellos, en funciones de si los sitios tienen la misma u opuesta dirección. Si los sitios están en moléculas de DNA diferentes o ambos son circulares se produce una inserción.
Transposición
Los transposones son segmentos de DNA presentes en todas las células que se mueven de un lugar del cromosoma a otro, la nueva localización es elegida más o menos al azar, si cayera en un cromosoma esencial, podría matar la célula. Las bacterias tienen dos tipos de transposones:
 Las secuencias de inserción o transposones simples, contienen las secuencias requeridas para la transposición y los genes para las proteínas que promueven el proceso.
 Los transposones complejos contienen genes, además de los necesarios. Pueden, por ejemplo, conferir resistencia a los antibióticos.
La mayoría tienen cortas secuencias repetitivas en cada extremo, que sirven de sitios de unión de trasposasa. Cuando ocurre la transposición una secuencia del sitio de inserción se duplica para formar una corta secuencia repetida adicional que flanquea cada extremos de transposón insertado.
Otra clasificación es teniendo en cuenta el tipo de codificación y si codifican transposasa o sorbosa, (transposasa que reconoce un tipo específico de secuencias).
 Clase I: simples, sólo tienen transposasa hay de dos tipos:
 Secuencia de inserción: el gen de la transposasa está flanqueada por secuencias repetidas e invertidas.
 Transposones compuestos, un gen que codifica para otra flanqueada (rodeada) por secuencias de inserción.
 Clase II: tenemos secuencias cortas que flanquean el elemento transponible y en el centro hay 3 genes, una para la transposasa, otro para la resobasa y otro.
 Clase III: Se encuentran en bacteriófagos, se integra el genoma en la célula huésped y siempre tiene un gen A para transposasa, un gen B que hace la transposición más rápida y otros que codifican proteínas estructurales.
Cuando se insertan en un cromosoma lo hacen mediante cortas secuencias en el genoma huésped para acoplarse a él. Siempre que se integra el transposín la secuencia se duplica porque la transposasa hace un corte escalionado. Una vez que ha cortado el DNA se integra el transposón que se flanquea por la secuencia diana.
En la transposición simple o directa el transposón es escindido ( separado) por cortes en ambos extremos y el transposón se mueve. Este proceso deja una rotura de cadena doble en el DNa donador. En el lugar de la inserción se produce un corte indentado, el transposón es insertado en la rotura y la replicación del DNA llena el hueco.
En la replicativa se replica el transposón completo dejando atrás una copia en el donador. El cointegrado es un intermedio de este proceso, consiste en la región dadora unida covalentemente al DNA del receptor. El cointegrado hay dos copias completas del transposón, ambas con la misma orientación relativa en el DNA.
Lesiones en el DNA y Mutaciones
Los cambios pueden producirse de forma espontánea, por mal funcionamiento de la polimerasa, por agentes ambientales o por agentes químicos.
Los agentes químicos pueden ser:
Nitritos, precursores del ác nitroso, llevan a cabo la desaminación de las bases, sufren modificaciones e incluso convertirse en otras bases distintas.
 Agentes Alquilantes, pueden producir cambios en apareamientos de ases. Mimetizan las bases, hacen que una se transforma y actúe como otra base.
 Agentes Químicos que producen Desporinaciones, hidrólisis del enlace N-β-glucosídico, rompen el enlace que une la base con la pentosa.
 Agentes oxidantes, pueden aparecer por radiaciones o por mal funcionamiento del metabolismo. Rotura de DNA.
Las mutaciones son cambios en la secuencia, permanentes y heredables. Pueden ser:
 Puntuales:
 Transiciones, se cambia una purina por una purina o pirimidina por pirimidina
 Transversiones, se cambia una base púrica por una pirimidinica.
 De cambio de Sentido, cambian el aa codificado.
 Sin sentido, generan un codón de terminación.
 Silenciosas, no afectan a DNA esencial o tienen efecto despreciable.
 Inserciones Y delecciones afectan a fragmentos. En las inserciones se añaden y en las delecciones se quitan. Afectan al marco de la lectura.
El mecanismo por el que se produce la transición de forma espontánea fue definido por Watson y Crick. Observaron que hay bases que cambian el estado de sus enlaces porque los átomos de H cambian su posición y forman tautómeros. Estos hacen que un apareamiento se pueda modificar de forma transitoria. Cuando se tautomeriza, una base, puede aparearse con una base distinta.
En los mamíferos hay correlación entre el cáncer y las mutaciones por lo que se aplicó el test de Ames para determinar si un agente es mutagénico o no.
Con una cepa de salmonella mutante que no es capaz de sintetizar histidina y solo es capaz de crecer en un medio con histidina. Se expone la cepa a supuestos agentes mutagénicos para que modifiquen el gen que no permite la síntesis. Luego pondrán las cepas en un medio sin histidina y con el agente mutagénico, si aparecen colonias es que ha activado el agente mutagénico.
Ames hizo 4 experimentos, en el 2º,3º y 4º depositó el agente en diferentes concentraciones. En el que más concentración, las colonias nacían lejos del disco. A concentraciones muy elevadas es letal.
Para conseguir que los agentes actúen en condiciones similares a seres vivos se añade a las cepas homogeneizado de hígado de rata, ya que muchos agentes mutagénicos son cancerígenos en contacto con sustancias del hígado.
Reparación
 Reparación por escisión de dímeros de pirimidina o nucleótidos: El más frecuentemente son los dímeros de T, se producen cuando las células están expuestas a rayos UV. La consecuencia es que la estructura del DNA queda bloqueada y no puede transcribirse ni replicarse.
En E coli el complejo enzimático clave es la ABC excinucleasa. Está formado por tres subunidades, UvrA, UvrB y UvrC. UvrA y UvrB efectúa un barrido del DNA y se une al lugar de la lesión. A continuación, el dímero de UvrA se disocia, dejando UvrB unida al DNA, UvrC se une a UvrB que realiza una escisión en el quinto enlace fosfodiéster en el lado 3’ de la lesión. UvrC efectúa una escisión en el octavo enlace fosfodiéster en el lado 5’. El hueco es rellenado por la DNA pol I y la DNA ligasa.
 Reparación por fotoreactivación: Reacción promovida por las DNA fotoliasas. Los dímeros de pirimidina son el producto de una reacción inducida por la luz y las fotoliasas utilizan energía procedente de la luz para invertir la lesión.
Reparación por escisión de base: Todas las células contienen DNA glucosilasas que reconocen lesiones y eliminan la base afectada rompiendo el enlace N-glucosilo. El resultado es un sitio apurínico o apirimidínico conocidos como sitios AP.
El más común es la desaminación de la C para obtener U que es eliminado por la uracilo glucosilasa. Una vez formado el sitio AP, otro grupo de enzimas ha de repararlo. La desoxirribosa 5’-fosfato es eliminada y reemplazada por un nuevo nucleótido. Las AP endonucleasas cortan la cadena que contiene el sitio AP; a continuación se elimina un segmento de DNA que contiene el sitio AP, este es reemplazado por la DNA polimerasa I y sellada por una DNA ligasa.
T y U únicamente se diferencian en el C5, la T está metilada. Si tuviésemos U en lugar de T en el DNA, el U se confundiría con la C desaminada y no se eliminaría correctamente una mutación.
 Reparación de apareamientos incorrectos: Se corrigen con la información contenida en la cadena molde, el sistema discrimina la cadena recién sintetizada. La célula consigue este objetivo marcando el DNA molde con grupos metilo.
La discriminación se basa en la acción de la Dam metiliasa que metila el DNA en la posición N6 de todas las adeninas presentes en la secuencia GATC.
La proteína MutL forma un complejo con la Mut S y se une a todos los pares mal apareados. La Mut H se une a la proteína Mut L y a las secuencias GATC que haya encontrado el complejo MutL- MutS. El paso del DNA a ambos lados del apareamiento incorrecto a través del complejo MutL-MutS forma un bucle de DNA. La proteína Mut H es una endonucleasa con especificidad de secuencia, que se mantiene inactiva hasta que el complejo encuentra una secuencia GATC semimetilada. En estos lugares, MutH cataliza el corte de la cadena no metilada por el lado 5’ de la G en GATC, marcando de este modo la hebra que se ha de reparar. Cuando el desapareamiento se encuentra en el lado 3’ del sitio de corte, la hebra
Sin metilar es desenrollada y degradada en dirección 3’-5’, a partir del sitio de corte hasta más allá del desapareamiento, siendo después reemplazada por nuevo DNA. Este proceso requiere la acción combinada de la DNA heliclasa, SSB y exonucleasa I
Síntesis de DNA propensa al error o respuesta SOS
A falta de una segunda hebra que pueda guiar la reparación, la información requerida debe proceder de un cromosoma homólogo separado. Depende, de la recombinación genética homóloga. Proceso denominado Reparación del DNA por Recombinación. Cuando las lesiones se producen en una cadencia inhabitualmente rápida se activa una nueva ruta, conocida como reparación propensa a error. Cuando este mecanismo está activado, la reparación del DNA es mucho menos precisa, aumentan la tasa de mutación. La reparación propensa al error es parte de la respuesta celular, al estrés causado por daños extensos y se conoce como respuesta SOS.