Pirosecuenciación

Principio del método de Pirosecuenciación:



Esta otra animación describe la implementación más difundida de esta tecnología de secuenciación, la que es comercializada por la firma 454 Life Sciences (Click en Genome Sequencer 20 System Multimedia; el enlace directo probablemente no funcione). En esta otra página hay una descripción del principio de este método (que incluye un video). Mas videos de secuenciación, aquí.

Biosíntesis de Proteínas

Tema 19, Biosíntesis de Proteínas
Traducción:
Están implicadas muchas macromoléculas, requiere GTP. Los ribosomas tienen 2 funciones, coordinan las interacciones de los RNA y proteínas, catalizan la formación de enlaces peptídicos. El de E coli está formado por proteínas y rRNA; en procariotas el coeficiente de sed es 70s, tiene 2 subunidades y tiene 50s y 30s, en eucariotas 80s, 60s y 40s. Las dos subunidades interaccionan entre ellas dejando un poro por el que entra el mRNA.
La subunidad grande de procariotas 50s está constituida por RNA 5s 23 y proteínas desde la L1 a L36, la pequeña está constituida por RNA 16s y proteínas desde s1 a s21.
En eucariotas, la grande tenemos los rRNA 5s, 28s, 5.8s y 49 proteínas y la menor 18s y 33 proteínas.
Los rRNA tienen estructura secundaria compleja con interacciones con ap intracatenarios, zonas dúplex. Pueden estar asociados a la transcripción.
El proceso tiene 3 etapas.
La primera fase se lleva a cabo en el citoplasma, anterior al inicio y se une el tRNA al aa mediante la aminoacil tRNA sintetasa. EL codón de inicio es el AUG (met). En todas las células hay 2tRNA de met uno para el codón de inicio y otro para las met que se encuentran en el interior de la secuencia.
En procariotas el primer aa es formil-metionina por lo que tenemos un tRNA f-met y un tRNA met. Todas las proteínas van a comenzar por N-formilmetionina porque ese grupo formilo se acopla a un lugar específico que tiene el ribosoma y no se puede acoplar a otro lugar.
En eucariotas hay dos tRNA para metionina. Uno es el tRNAiniciador y otro para la met en la cadena. La diferencia está relacionada con el CAP5. Las mitocondrias y cloroplastos utilizan N-formilmetionina.
Un mismo mRNA puede estar leído por varios cromosomas a la vez y puede sintetizar varias prot a la vez. Las que están más cerca del extremo 5’ tendrán la síntesis más avanzada.
Al conjunto de ribosomas traduciendo un mismo mRNA se denomina polirribosomas, aumentan la eficacia de utilización del mRNA.
Etapas
Inicio
Necesitamos la subunidad ribosómica 30s, el mRNA, el primer tRNA con la formilmetionina, GTP, Mg2+, la subunidad 50s y 3 factores de inicio el I, II y III.
1er paso: La subunidad 30s forma interacción con el IF1 y el IF-3; este último impide que se una la subunidad 50s antes de tiempo. A continuación se une el mRNA específicamente de modo que el codón AUG se une al sitio p.
La diferencia del primer codón AUG se lleva a cabo por la secuencia Shine. Dalgarno que se encuentra delante de ese codón hacía 5’ a unas 10pb. Esta secuencia rica en bases púricas hace que el ribosoma sepa que el siguiente AUG es el codón de inicio. La secuencia Shine Dalgarno actúa como activador y es complementaria a una secuencia del rRNA 16s.
En los ribosomas existen tres sitios A P y E. El sitio A y P están constituidos por la 30s y la 50s pero el E solo por la 50s.
 2º Paso, tenemos un complejo formado por GTP, Mg, el tRNA de la met y IF2 y se une al complejo de la subunidad 30s que se ha conformado en el primer paso.
3er Paso, Mediante una hidrólisis del GTP se favorece la liberación de los tres IF y se permite la unión de la 2ª subunidad, la 50s.
Una vez conseguido todo esto tenemos el complejo de inicio con el sitio A y el E libres y el sitio P ocupado por el tRNA de la f-met.
En eucariotas existen muchísimos más factores de inicio. Uno de ellos, la eIF4B es la fijadora del casquete 5’ del mRNA formando un complejo entre la subunidad 40s y el mRNA. Después se hace un barrido del RNA para encontrar el 1er AUG.
Elongación
Adición de los aa. Necesitamos el complejo de inicis, los aminoacil tRNA y otros factores, EF-TU, EF-FS y EF-G.
1er paso, el tRNA siguiente de la cadena se tiene que colocar al sitio A. Antes se ha unido el EF-TU y un GTP que se untirá al sitio A para liberarse el EF- TU y GDP. Mediante la hidrólisis del GTP se une el aminoacil tRNA al sitio a mediante un proceso cíclico con la ayuda del EF-TS se regenera el GTP para que el EF-TU pueda volver a funcionar. Se une el 2º Aminoacil. tRNA.
2º Paso, formación de E. P, se forma el enlace peptídico entre los aa. El residuo de N-formilmetionina se desplaza para formar el enlace. En el sitio P tendremos el tRNA desacilado y en el sitio A el tRNA tiene 2aa. Proceso catalizado por el rRNA 23s que actúa de ribozima.
3er Paso, la translocación, tras la formación del peptídico, el ribosoma se mueve de forma que el dipeptidil tRNA pasa del sitio A al sitio P. EL tRNA desacilado
Pasa del sitio P al E y pasa al citosol, queda libre. En el sitio A se incorpora el 3º tRNA. Este proceso es la translocación y necesita el 3º factor EF-G que necesita GTP como fuente de Eª. Para que se incorpore un nuevo aa, se repiten los 3 pasos.
La elongación es un proceso costoso energéticamente ya que se gastan 2 moléculas de GTP. Siempre en la cadena naciente el polipéptido queda unido al tRNA que lleva cargado el último aa que se ha incorporado. Existen otros métodos para corregir errores, porque hay dos lugares donde se pueden producir errores, en el que actúan las +-RNA sintetasas cuando un aa está mal unido al tRNA y cuando codón y anticodón no están bien apareados. En el tiempo que tarda en unirse el codón y el anticodón se comprueba si los apareamientos son correctos. Proceso de corrección de pruebas.
En total, para formar un enlace peptídico gastamos 4 enlaces de alta energía, más 1 del inicio.
Terminación
En procariotas son 3 factores de terminación para adjuntar el codón de terminación correspondiente. Son 3 codones de terminación UAA, UAG, UGA que aparecen después del último aa.
Además de 3 factores RF1, RF2 y RF3
En primer lugar se requiere de la hidrólisis del enlace peptidil tRNA terminal y la liberación del polipéptido libre, luego se disocia el ribosoma en sus unidades.
Una vez en el codón se une actúa uno de los factores RF1 actúa con UAG y UAA, RF2 con UGA y UAA y el RF3 no se sabe. Los RF1, RF2 transfieren el polipéptido naciente a una molécula de agua de modo que la molécula queda libre en el citosol.
El último paso es la disociación de las 2 subunidades de los ribosomas.
En eucariotas solo se ha encontrado un factor de liberación, el ρ RF1, que reconoce los codones de terminación. No hay secuencias shine dalgarno, por ello se reconoce la primera tRNA interaccionando con el CAP 5’ con el primer codón AUG. Se lleva o por las heliclasas que necesitan ATP y ayudan al ribosoma a encontrar el primer AUG.
Plegamiento Y Modificaciones post-traduccionales.
Las proteínas se pliegan y se transportan a su lugar de destino. Durante la síntesis comienza a producirse estructuras secundarias. Además, sufren modificaciones post-traduccionales.
 Las modificaciones post-traduccionales incluyen:
ü Modificaciones amino- y carboxilo-terminales.
ü Pérdidas de secuencias señal.
ü Modificación de aminoácidos concretos:
Fosforilación – Carboxilación – Metilación - Hidroxilación
ü Unión de cadenas laterales de glúcidos.
ü Adición de grupos isoprenilo.
ü Adición de grupos prostéticos.
ü Modificación proteolítica.
ü Formación de puentes disulfuro.
También se pueden modificar aa, producirse adiciones… Y se forman los puentes disulfuro que completan su plegamiento para dar lugar a su estructura final.
Inhibición
Se puede inhibir mediante:
 Puromicina, antibiótico que se parece estructuralmente al extremo 3’ del RNA y la transferasa transfiere la cadena naciente a la puromicina que para la síntesis dando lugar a proteínas incompletas. Se fija al sitio A.
 Cloranfelicol, bloque a la transferencia de la cadena naciente, es un antibiótico.
 Tetracidina, bloquea el sitio A.
 Estreptomicina, actúa en ribosomas de procariotas de modo que baja [] altera el marco de lectura y alta, inhibe la síntesis.
 Ciclo hemiximidina, bloque la peptidil-transferasa en eucariotas, y obtenemos prot incompletas.
 Toxina diftérica, producida por una bacteria del ap respiratorio. Bloquea la translocación y no deja que se continúe la síntesis, solo afecta en eucariotas.
Destino de Proteínas
 Al medio /t se integre en la membrana plasmática/lisosoma, siempre tiene que pasar por el RE y el Aparato de golgi.
 Mitocondria cloroplastos núcleo siguen rutas específicas.
 Citosol, permanecen donde se han sintetizado.
Necesitan secuencias señal dispuestas en el extremo amino terminal que determinan su destino. Cuando llega al destino esas secuencias señal se eliminan.
Tienen una estructura similar con entre 10y 20 residuos hidrofóbicos cargados positivamente.

El Código Genético

Tema 18, El Código Genético
Es la relación entre las secuencias de bases del DNA y la secuencia de aa. Está formado por tripletes, los codones. La secuencia se lee de forma continua sin solapamientos y hay marcas de lectura, concretamente tres por cada hebra.
Existen diferentes codones que codifican para un mismo aa. De los 64codones, 61 codificarán aa y los otros 3 son codones de terminación o secuencias stop, UAA, UGA y UAG. Metionina y triptófano están codificados por un solo codón.
El código genético está degenerado, tenemos varios codones para 1 aa. Además siempre hay un codón de inicio, el AUG que codifica para la Metionina, muchas veces aparece la metionina en el primer lugar.
Las dos primeras bases del codón son los determinantes primarios de la especificidad ya que, cambia la última.
Los marcos de lectura abiertos tienen como mínimo 50 codones, sin ninguno de Stop, son los que normalmente codifican genes.
Interacciones Codón-Anticodón
Los tRNA tienen una secuencia que se aparea con un codón del mRNA se llama anticodón, y se aparea antiparalelamente con el codón del mRNA. Este apareamiento es bastante débil y no se dan los apareamientos de Watson y Crick, además el tRNA tiene iosinato, una base modificada que se puede aparear con U, C y A. Si tenemos en el anticodón el I en primera posición, puede reconocer 3 codones diferentes.
Los puentes de H que se forman en las dos primeras bases son más fuertes que el tercero, por eso se habla de teoría del balanceo, que dice que las dos primeras bases se forman apareamientos de Watson y Crick con el anticodón mientras que en la primera base del anticodón está más débil y no tiene apareamiento convencionales por lo que podrá unir el anticodón con uno, dos o tres codones distintos dependiendo de qué base haya en la primera posición.
El hecho de que esa tercera sea débil facilita la síntesis de proteínas porque facilita la disociaición del tRNA y el mRNA y hace el proceso más rápido.
El nº mínimo de tRNA que necesita una célula es de 32. El código genético es casi universal porque existen excepciones en mitocondrias y en protozoos ciliados.
RNA de transferencia

Se adaptan a los mRNA y los aa. Su secuencia sigue un modelo de hoja trébol. La mitad de sus bases están apareadas. Suele tener entre 7 y 15 bases modificadas, metiliciones de bases, hacen que sus características hidrofóbicas aumenten. Su extremo 5’ siempre termina con una guanina fosforilada y el extremo 3’ con un triplete CCA3’, juntos forman el brazo del aa. El aa cuenta con distintos brazos, en primer lugar, el brazo TψC con ribotimidina, pseudouridina y citidina; el siguiente es variable; después el brazo del anticodón con 7 bases, 3 de las cuales son constantes; y por último el brazo dhu o D que la estructura terciaria que adquiere es de L retorcida, con 2 segmentos perpendiculares. Hay regiones que no la tienen y forman puentes de H entre bases que no guardan los apareamientos de Watson y Crick.
Aminoacil tRNA Sintetasas
Sintetizan el primer paso en una traducción, es una unión del tRNA con su aa específico que viene definido por el anticodón que interacciona con el codón del mRNA. Existe una aminoacil-tRNA sintetasa para cada aa.
La activación se lleva a cabo en dos reacciones.
 En un primer paso tenemos la unión del aa con una molécula de ATP, obtenemos pirofosfato y aminoacil-AMP; genera energía que se emplea en el siguiente paso.
 En el segundo paso el amonoacil-AMP interacciona con el tRNA para obtener aminoacil-tRNA y AMP libre.
El balance de energía es 0, es un proceso exergónico e irreversible. Requiere magnesio.
Existen diferencias entre las distintas aminoacil-tRNA sintetasas y por ello se clasifican en clase I y II. Las de clase I son monoméricos y las de clase II son diméricos. La reacción tiene dos objetivos, activar el aa y unirlo al tRNA. La enzima tiene la capacidad de corregir los errores, gracias a que tiene dos centros, el de acilación, activación y el hidrolítico, que revisa. Puede detectar el error en el 1º o en el 2º paso. El error que no detecta un control lo puede detectar el otro; los errores que se corrigen en el centro de acilación.
El tRNA tiene que ser reconocido por la aminoacil sintetasa pero no hay regla que indique las bases fijas que reconoce porque puede reconocer entre 7 y 10 bases de toda la molécula de tRNA.

Transcripción del DNA y Maduración

Tema 17, Transcripción del DNA y Maduración.
El DNA tiene que pasar a ser RNA para sintetizar proteínas. La transcripción es el proceso. Se parece a la replicación en su mecanismo, la polaridad y la utilización de un molde. La transcripción tiene fases de inicio, elongación y terminación. No requiere cebador y está limitada a cortos segmentos de la molécula de DNA. Además, dentro de los segmentos transcritos sólo una de las hebras del DNA sirve de molde. La transcripción se centra en un solo gen o en un grupo de genes.
La RNA polimerasa dependiente de DNA
Requiere cuatro ribonucleótidos 5’-trifosfato (ATP, GTP, UTP y CTP como precursores de los nucleótidos, así como Mg2+. La RNA pole longa una cadena de RNA y sintetiza el RNA en dirección 5’3’.
La pol requiere DNA para su actividad, siendo más activa con un molde de DNA bicatenario, solo se utiliza una de las dos hebras. La hebra molde es copiada en dirección 3’-5’. Cada nucleótido en el RNA recién formado se selecciona según las interacciones de apareamiento de bases de Watson y Crick; los residuos de uridilo se insertan en el RNA para aparearse con adenilato en el DNA molde. La RNA pol no requiere un cebador.
Las dos hebras de DNA tienen papeles diferentes. La hebra que sire de molde se denomina hebra molde. La hebra complementaria del molde, la hebra no molde o codificante, es idéntica en secuencia de bases al RNA, con U en lugar de T. La secuencia puede estar situada en cualquier de las hebras.
La RNA pol dependiente de DNA es una enzima compleja y de gran tamaño con 5 subunidades núcleo y otra perteneciente al grupo σ. La subunidad σ se une transitoriamente al núcleo y dirige la enzima hacia sitios específicos de unión en el DNA. Estas seis subunidades constituyen la holoenzima según el tipo de subunidad σ. La más común es σ70.
Las RNA pol carecen de actividad exonucleasa 3’-5’ correctora de pruebas.
El inicio en puntos al azar sería un proceso sumamente antieconómico, por ello la RNA polimerasa se une a secuencias específicos denominados PROMOTORES, las cuales dirigen la transcripción. Las secuencias son idénticas pero los que se encuentran con mucha más frecuencia forman una secuencia consenso. La secuencia consenso en la región -10 es TATAA 5’-3’; la secuencia en la región-35 es TTGACA 5’-3’. Un tercer elemento rico en AT, denominado elemento UP se encuentra en los promotores de genes con un nivel de expresión elevado entre -40 y -60. La eficacia y el inicio de la transcripción en un promotor de pende en buena medida de estas secuencias, del espaciado y de la distancia del sitio de inicio de la transcripción.

Etapas de la Transcripción.
Inicio: Se produce cuando la RNA pol se une a los promotores. El grupo 5’-trifosfato del primer residuo de una cadena nueva no es cortado para liberar PPi, sino que se mantiene intacto durante toda la transcripción. Primero se une a la secuencia de -35 y desenrolla en la región de -10 una secuencia de 17 pares de bases rica en T y A. Cuando las dos hebras se separan se forma un Complejo Abierto en el que comienza la síntesis de RNA.
Cuando la pol se une al DNA pierde el factor σ se acopla únicamente a la hebra molde cuando va a comenzar. El σ estándar es el σ70 pero en E coli hay muchas más como σ32 que se sintetiza cuando se somete a una elevada temperatura.
En ocasiones hay otras secuencias promotoras a las que se unen proteínas que activan o inhiben. Si en las regiones promotoras se dan mutaciones el gen será erróneo y habrá modificaciones en la transcripción.
Elongación: Comienza después de la formación del primer enlace fosfodiéster. La pol no tiene factor σ, ahora irá leyendo la secuencia molde y sintetizado el RNA. El extremo en crecimiento de la nueva cadena de RNA se aparea temporalmente con el DNA molde para formar una doble hélice híbrida de una longitud de ocho pares de bases. EL RNA en este dúplex híbrido se despliega y se restablece el dúplex de DNA. La elongación se llevará a cabo hasta que haya unas secuencias que indiquen que ya ha acabado, se encuentran en el RNA transcrito.
Terminación: E coli posee al menos dos clases de señales de terminación, una clase actúa mediante un factor proteico ρ mientras que la otra es independiente de ρ. (rho)
 La clase independiente de ρ tiene dos rasgos distintivos. El primero es una región cuyo transcrito de RNA tiene secuencias autocomplementarias que permiten la formación de una estructura en horquilla cortada 15 a 20 nucleótidos antes del final de la hebra de RNA. El segundo rasgo es una serie de adinelatos en la hebra molde que se transcriben como uridilatos en el extremos 3’del RNA. Cuando la polimerasa llega a un sitio de terminación se detiene. La formación de la estructura en horquilla puede desorganizar la interacción entre el RNA y la RNA pol facilitando la disociación del transcrito.
 Los dependientes de ρ carecen de la secuencia de adenilatos repetidos en la hebra molde, pero tienen una secuencia corta que se transcribe formando una horquilla. La proteína ρ se une al RNA en sitios específicos y migra en la dirección 5’-3’ hasta encontrar el complejo de transcripción detenido en el sitio de terminación. Contribuye a facilitar la liberación del transcrito, la proteína ρ posee actividad RNA-DNA heliclasa dependiente de ATP, que promueve la translocación de la proteína.
RNA polimerasas Eucarióticas
Tienen tres RNA polimerasas, complejos distintos con subunidades en común:
 La RNA pol I es responsable de la síntesis de un solo tipo de rRNA 18s, 5.8s y 28s.
 La principal función de la RNA pol II es la síntesis de mRNA y de algunos RNA especializados. Reconoce miles de promotores cuyas secuencias pueden diferir. Muchos promotores reconocidos tienen características comunes entre las que se encuentra la secuencia TATAA cerca del par de bases -30 y una secuencia Inr iniciador, cerca del inicio de transcripción.
 La RNA pol III produce tRNA, el rRNA5s y algunos otros RNA especializados de pequeño tamaño, los promotores reconocidos por la RNA pol III están bien caracterizados.
La RNA pol II tiene promotores específicos en la región de -25. Está la caja TATA con 6 pares de bases TATAAA, en este punto empezará a formar la burbuja de replicación. A continuación estará la caja GC y la caja CAAT.
Inhibición de la Transcripción
Casi todos los inhibidores son antibióticos que inhiben la actividad de la pol.
 En procariotas:
Rifamicina B y rifampicina, inhiben la síntesis de RNA al unirse a la subunidad β de las RNA pol, impidiendo el desalojo del promotor.
Cordicepina, inhibe la elongación.
 En eucariotas:
α amanitina, impide la formación de mRNA en las células animales al bloquear la RNA pol II y a altas concentraciones también la III.
 Comunes:
Actinomicina D que inhibe la elongación; la porción plana de esta molécula se intercala en el DNA deformándolo e impidiendo el paso de la pol.
Daunomicina y adrianomicina, se unen al DNA bicatenario e impiden que se formen las burbujas de transcripción y replicación.
Maduración del RNA
Todas las RNA son modificadas después de su síntesis, las Ribozimas que catalizan están constituidas por RNA.
Una molécula de RNA recién sintetizado se denomina transcrito primario. Los fragmentos que interrumpen la región codificante son los intrones y los codificantes exones. En el splicing los intrones son eliminados del transcrito primario y los exones son unidos para forman una secuencia que especifique un polipéptido funcional. Un residuo modificado denominado casquete en 5’ es añadido en el extremo 5’, el extremo 3’ es cortado y se añaden unos 80 a 250 residuos de adenilato para formar una cola de Poli A.
 Eliminación de intrones, sólo se encuentran en eucariotas, arqueas y virus. Los intrones tienen motivos estructurales comunes, todos empiezan por GU, en el 5’ y acaban por AG en 3’; además, aparece un centro de ramificación, a unos 20 nucleótidos. Existe un mecanismo general de splicing:
En primer lugar se produce una rotura de un enlace fosfodiéster en el punto de empalme 5’ por hidrólisis provocada por un ataque neofílico del extremo 2’hidroxilo de un residuo de adenina en el centro de ramificación para crear un enlace fosfodiéster entre esa adenina y la guanina del punto de empalme del intrón, se forma un enlace 2’-5’. A continuación el extremo 3’ del exñon 1 va a reaccionar en el punto de empalme 3’ del intrón, generándose un enlace entre el exón 1 y el 2 y el intrón queda libre con una estructura de enlace σ.
El corte y empalme requiere la acción de complejos RNA-proteína especializados, denominados pequeñas ribonucleoproteínas nucleares SnRNP. Cada SnRNP contiene un RNA de 100 a 200 nucleótidos de RNA eucariónticos llamados pequeños RNA nucleares SnRNA- En los núcleos eucarióticos se encuentran cinco SnRNA ( U1,U2, U3, U4, U5, y U6) implicados en las reacciones de corte y empalme.
El SnRNA U1 contiene una secuencia complementaria de secuencias próximas al sitio 5’ de corte y empalme de los mRNA nucleares con la que la SnRNP U1 se une a esta región del transcrito primario. La adición de las SnRNP U2, U4, U5 y U6 conduce a la formación de un complejo de corte y empalme llamado espliceosoma, dentro del que tiene lugar la reacción de corte y empalme.
Al transcrito primario se le une la SnRNP U1 en el centro de empalme 5’ del intrón. Posteriormente se une la SnRNP U2 al centro de ramificación, al residuo de adenina con el gasto de ATP. Después, la unión de un complejo de SnRNP U4 y U5 da lugar al esplieceosoma en el que los residuos de A y B se quedan muy próximos. Requiere ATP, una vez formado el espliceosoma se eliminan los intrones y cuando este se separa, los exones quedan unidos.
Ciertos tipos de RNA son capaces de eliminar sus propios intrones sin moléculas extra, se le denomina autosplicing. Se observó en un protozoo y en ciertos rRNA de cloroplastos de unicelulares y en mitocondrias de levaduras y hongos. Existen distintos tipos de mecanismos que difieren en la naturaleza del atacante que rompe el enlace entre en intrón y el exón. Existen dos tipos, los del tipoI, que tienen como grupo atacante un grupo extra de guanosina, y los del tipo II tienen como grupo atacante la adenina.
El cofactor de guanosina forma un intermediario con el extremo 5’ del intrón.
En las de Tipo II y en el espliceosoma el intrón se elimina en forma de lazo, en el tipo I el intrón se libera en forma lineal, pues el residuo de guanosina se une al extremo 3’ del intrón.
Modificaciones en el RNA
Modificaciones en mRNA
En eucariotas, los mRNA maduros tienen rasgos estructurales distintivos. La mayoría tiene un casquete en 5’, un residuo de 7-metilguanosina unido al residuo 5’-terminal del mRNA a través de un enlace 5’,5’-trifosfato. En el extremo 3’ la mayoría de mRNA tienen una serie de 80 a 250 residuos de adenilato, denominada cola de poli a.
Existen modificaciones, en el 5’ se produce una adición de Z-metilguanosina mediante un enlace 5’-5’-trifosfato. Se una el residuo de guanosina y se produce una metilación. El residuo del final es CAP 5’, si sólo se metila la guanosina CAPO, si hay además una ribosa metilada CAP1, si hay dos CAP2. El CAP 5’ se añade una vez transcritos 20 nucleótidos, protege el transcrito del ataque de fosfatasas y nucleasas.
En el extremo 3’ se adiciona la cola de pola A de 20 a 250 adenilatos que no vienen codificados en el DNA, se añaden de forma extra. En el transcrito primario existe una secuencia de 6 nucleótidos reconocida por una endonucleasa, se une y elimina todo el RNA que se encuentra a unos 20-30 nucleótidos de la secuendcia diana. Ahora actúa la poliadenilato polimerasa que utiliza ATP como fuente de adenilato para añadir residuos de A en el extremo de entre 30 y 250, utiliza como cebador la molécula de mRNA anterior al extremo OH.
Maduración de los rRNA y tRNA
Los RNA ribosómicos se forman a partir de precursores más largos denominados RNA prerribosómicos, se transcribe una secuencia completa de RNA, se eliminan los intrones y se transcribe cortando las secuencias para sintetizar los rRNA.
Los precursores de tRNA (imagen) pueden ser modificados. El trinucleótido 3’-terminal CCA 3’ está ausente y es añadido durante el procesamiento por la tRNA nucleotidotransferasa, que une los tres ribonucleósidos trifosfato precursores en sitios activos separados y cataliza la formación de los enlaces fosfodiéster para producir la secuencia CCA 3’. La etapa final del procesamiento del tRNA consiste en la modificación de algunas bases.
Diferencias:
En eucariotas la trancripción tiene lugar en el núcleo y la traducción en el citoplasma
En procariotas todo ocurre en el mismo lugar permitiendo que sean simultáneos.
Transcriptasa inversa:
Ciertos virus contienen dentro de la partícula vírica una DNA pol denominada Transcriptasa inversa. Durante la infección, la RNA mocohebra y la enzima penetran en la célula huésped. La retrotranscriptasa cataliza la síntesis de una cadena de DNA complementaria del RNA vírico, y degrada la cadena de RNA del híbrido RNA-DNA y lo reemplaza con DNA. El DNA dúplex queda incorporado en el genoma de la célula huésped. Estos virus son llamados retrovirus.
Han jugado n papel importante en el avance del conocimiento molecular sobre el cáncer. La mayoría no matan a sus células huésped, sino que permanecen integrados en el DNA celular y se replican con el mismo. Algunos contienen un oncogén que provoca que la célula crezca anormalmente.
El VIH es un retrovirus. El VIH mata muchas de las células que infecta principalmente linfocitos T.

Replicación, Recombinación, Mutación y Reparación del DNA

Tema 16, Replicación, Recombinación, Mutación y Reparación del DNA
Para dar a cada célula hija la misma información se ha de duplicar el DNA, este proceso de denomina replicación. Existe un amplio sistema enzimático que controla este proceso y vela porque se lleve a cabo correctamente.
Cada cadena actúa de molde para la síntesis de una nueva cadena. Es semiconservativa.
Meselson y Stahl cultivaron cel de E. coli durante varias generaciones en un medio con 15N, después sometieron el DNA aislado de este cultivo a un gradiente de CsCl y obtuvieron que pesaba un 1% más que el DNA normal.
Células de E coli cultivadas en medio con 15N fueron transferidas a un medio que contenía 14N, donde se las dejó crecer hasta la duplicación de la polación. Formó una única banda en el gradiente de cloruro de cesio en una posición que indicaba que los DNA eran híbridos. La hipótesis se confirmó cuando se permitió que las células volviesen a doblar su nº. El DNA aislado de este segundo ciclo mostró dos bandas una con la densidad del DNA ligero y otra con la del híbrido.
Cairns mediante autorradiografía proporcionó la primera indicación de que la replicación era un proceso coordinado. Incorporó radioactividad en el DNA de E coli cultivando las células en un medio que contenía timidina marcada con tritio 3H. El DNA radioactivo de las células en replicación mostraba un bucle extra, resultado de la formación de dos cadenas hijas radiactivas, cada una complementaria de una cadena principal. Las dos cadenas se replican simultáneamente, es bidireccional.
Los bucles de replicación se inician en un punto único denominado origen. En el DNA circular, las dos horquillas de replicación vuelven a encontrase en el lado opuesto al origen.
Las cadenas de DNA siempre son sintetizadas en la dirección 5’3’, siendo el 3’OH libre el punto de elongación del DNA. Debido a que son antiparalelas, la cadena que actúa de molde es leída del extremo 3’ al 5’. Okazaki descubrió que una de las cadenas nuevas de DNA se sintetiza en forma de trozos cortos, fragmentos de Okazaki. La cadena contínua o conductora es aquella sintetizada en dirección 5’3’ la misma que va la horquilla y la cadena rezagada es la sintetizada en 3’5’ opuesta a la horquilla. Los fragmentos se unen mediante la DNA ligasa.
DNA polimerasa:
Duplica el DNA, requiere un molde, la reacción está dirigida por una cadena molde de DNA según las reglas de apareamiento. Es necesario un cebador, segmento de cadena con un grupo 3’-hidroxilo al cual pueden añadirse nucleótidos. El extremo 3’ del cebador se denomina extremo cebador. Las polimeraras de DNA sólo son capaces de añadir nucleótidos a una cadena preexistente, por ello estos son de RNA porque la RNA pol si que puede empezar a codificar sin un cebador.
Una vez acabada la polimerización, obtendremos un fragmento de RNA llamado primer, con uno de DNA. Posteriormente, el DNA sufrirá una maduración en la que se eliminarán los cebadores.
Después de añadir un nucleótido a una cadena creciente de DNA, la DNA pol se disocia o se traslada a lo largo del molde y añade otro nucleótido. El proceso es más rápido si la pol añade nucleótidos sin disociarse. El nº de nucleótidos añadidos antes de una disociación es su procesividad. Cuanto mayor sea, mayor efectividad y mayor será la velocidad.
 La DNA polimerasa I, realiza multitud de funciones de limpieza durante la replicación, la recombinación y la reparación. Funciones potenciadas por su actividad exonucleasa 5’3’ mientras que la 3’5’ lleva a cabo la corrección de pruebas, la actividad exonucleasa 5’3’ es capaz de reemplazar un segmento de DNA o RNA apareado a la hebra molde en un proceso de traslado. Esta función se localiza en el fragmento de Klendw. Tenemos 2 actividades pol:
► La exonucleasa 3’5’ elimina nucleótidos que no aparean bien con la hebra molde. Comprueba si los apareamientos son correctos, mediante 2 centros activos, uno polimeriza y otro relee lo que se ha sintetizado. SI se incorpora un nucleótido que no está apareado se crea el enlace fosfodiéster, pero cuando se comprueba, se detecta el apareamiento incorrecto y la actividad se detiene para corregir el error, se repara hidrolizando el enlace fosfodiéster con el centro activo de exonucleasa y se incorpora un nucleótido correcto.
►La exonucleasa 5’3’ se añade a una muestra de DNA y comienza a eliminar nucleótidos que están mal al mismo tiempo que va añadiendo los oligonucleótidos que están mal al mismo tiempo que va añadiendo los oligonucleótidos correspondiente lo que se hace es trasladar el fragmentso unos 10 nucleótidos más adelante. Sirve para reemplazar los cebadores de RNA.
 La DNA pol II, no es muy conocida.
 La DNA pol III, similar a la I y en E coli recibe el nombre de DNA replicasa. Tiene 10 subunidades, cada una con una actividad diferente; la actividad polimerasa se encuentra en la subunidad α y la exonucleasa únicamente exonucleasa 3’5’, en las subunidad θ, es la correctora de pruebas. Tiene mayor procesividad que la del tipo I gracias a las subunidades β, que impiden la disociación.
La replicación del DNA requiere muchas enzimas, al conjunto se denomina Sistema DNA Replicasa o Replisoma y se compone por:► Helicasas separan las hebras utilizando la energía química del ATP.
► Proteínas fijadoras de unión al DNA, estabilizan las hebras e impiden que se vuelvan a unir.
► Topoisomerasas alivian las tensiones topológicas creadas por el desenrollamiento de las cadenas.
► DNA Ligasas unen los fragmentos de DNA sintetizados y actúan de distinta forma dependiendo de si están en E coli o en otro organismo. Requieren energía para unir los fragmentos de DNA, excepto en E coli donde se requiere NAD.
REPLICACIÓN DEL DNA
Se lleva a cabo en 3 procesos continuos.
Iniciación:
En E coli sólo hay un punto de inicio, el oriC, una secuencia de 245p.bases con una serie de 3 repeticiones cortas con13p.b. y otra de repeticiones no consecutivas con 9pb. Tienen secuencias consenso, secuencias que se repiten en la misma posición en todas las especies, se obtienen de la comparación de E coli con otras bacterias.
Es la proteína DNAA, un complejo formado por unas 20 moléculas de proteína DNAA se une a las cuatro repeticiones de 9pb en el origen a continuación reconoce y sucesivamente desnaturaliza el DNA en la región de las repeticiones de 13pb ricas en A=T y que empiezan por la secuencia GATC. Este proceso requiere ATP y la proteína bacteriana HU, del tipo de las histonas. A continuación la DNAB se une a esta región. Dos exámenes de DNAB, uno en cada hebra actúan de heliclasa, desenrollando el DNA de manera bidireccional y creando dos horquillas de replicación potenciales. Muchas moléculas de SSB se fijan de manera cooperativa al DNA de cadena sencilla, estabilizando las cadenas separadas e impidiendo su Renaturalización, mientras que la ligasa alivia la tensión topolígica creada por la DNAB heliclasa.
Elongación
Consiste en dos operaciones relacionadas, la síntesis de la cadena conductora y la síntesis de la cadena rezagada. En ambas cadenas son importantes varias enzimas que se encuentran en la horquilla de replicación como polimerasas, primasas heliclasas y topoisomerasas.
La síntesis de la cadena conductora empieza con la síntesis de un cebador corto de RNA por la primasa en el origen. A continuación la DNA pol III adiciona desoxirribonucleótidos a este cebador. Una vez iniciada la síntesis transcurre de manera contínuo.
 La síntesis de la cadena rezagada se realiza a trozos y en sentido contrario a la apertura de la horquilla. Primero, un cebador es sintetizado por la primasa y la DNA pol III añade los desoxinucleótidos.
Ambas hebras son producidas por un dímero asimétrico de NA pol III. Para ello la hebra rezagada forma un bucle y aproxima los dos puntos de polimerización.
La heliclasa DNAB y la primasa DNAH constituyen una unidad funcional dentro del complejo de replicación, denominado Primosoma. Un juego de subunidades núcleo de la DNApol II circula entre un fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el bucle formado por la hebra rezagada. Para cada fragmento de Okazaki un cebador que después será sustituido por DNA por la polimerasa I y se unirán gracias a la DNA ligasa.
Terminación
Las dos horquillas de replicación del cromosoma circular se encuentran en una región terminal que contiene múltiples copias de una secuencia de 20pb denominada Ter, actúan como una especie de trampa donde una horquilla puede entrar pero no salir. Dependiendo del sentido actúan unas u otras, en el sentido horario: Ter c, Ter b, Ter F o Ter g, en el sentido antihorario: Ter h, Ter b y Ter d. Las secuencias de terminación son polares porque no hay señal que sirva para ambos sentidos, cada secuencia es específica. Las secuencias Ter son lugares de unión para una proteína denominada Tus. El complejo tus-ter puede detener la replicación, el primero con que topa una horquilla. La otra se detiene cuando encuentra a la primera.
El resultado son dos cromosomas circulares ligados en el espacio, catenados. La separación requiere topoisomerasa IV.
Características de la Replicación en Eucariotas.
Se han identitificado en eucariotas orígenes de replicación, replicadores. Los de levadura abarcan unos 150pb y contienen varias secuencias esenciales conservadoras. En todas los eucariotas, la iniciación necesita de un complejo proteico de múltiples subunidades, el complejo de reconocimiento del origen ORC, que se une a varias secuencias dentro del replicador. El ORC interacciona y es regulado por diversas proteínas implicadas en el control del ciclo celular.
La velocidad de la horquilla de replicación de los cromosomas tiene lugar bidireccionalmente a partir de múltiples orígenes situados entre 30.000 y 300.000 pb uno del otro. Aparecen los replicones, segmentos de pb alrededor de un origen. La actividad de estos se inicia con la producción de los cebadores. Los fragmentos de Okazaki son más cortos.
Actúan varios tipos de DNA pol, todas en el núcleo excepto la de tipo γ, encargada de replicar el DNA mitocondrial. En la replicación de los cromosomas nucleares interviene la DNA pol α, en asociación con la DNa pol δ. La DNA pol α está formada por múltiples subunidades, una de las cuáles tiene actividad primasa y la mayor contiene actividad de polimerización, carece de actividad 3’5’ y probablemente actúe en la síntesis de los cebadores de los fragmentos de okazaki. Estos cebadores alargados por la DNA pol δ. Asociada con la proteína PCNA, que la estimula. La PCNA forma una abrazadera circular que potencia la procesividad de la enzima.
La DNA pol E puede reemplazar a la δ y actuar en la horquilla de replicación.
En la replicación también actúan otros complejos proteicos. La RPA es una proteína de unión a DNa de cadena sencilla equivalente a la SSB. La RFC es necesaria para la unión del PCNA y facilita la formación de complejos de replicación activos.

La terminación de la replicación de los cromosomas lineales incluye la síntesis
De telómeros, en los extremos del cromosoma, tienen una longitud de entre 1 y 12kb formados por secuencias de 6-8pb que se repiten como máximo 4 veces. Normalmente la hebra TG es más larga que la CA y se forman extremos cohesivos. El extremo TG es rico en guanina y el final del telómero adquiere una estructura de lazos, lazos T, estructuras internas en la hebra CA.
En las hebras retrasadas la polimerasa no puede interaccionar en el extremo 5’ porque no puede eliminar el cebador. Por ello, en cada ciclo celular el telómero se acorta. La longitud de los telómeros está relacionada con el envejecimiento celular. Aunque también existen las telomerasas que elongan, están compuestas por RNA y proteínas. La parte de RNA es rica en C y funciona como complementario del extremo 3’ del telómero para unirse y elongarlo. La telomerasa añade una secuencia de 6 nucleótidos al 3’. Sin embargo con el tiempo dejan de actuar de forma correcta.
Recombinación
Intercambio o movimiento de secuencias dentro del DNA; proceso que ha permitido el cambio de caracteres en un organismo los procesos, se dividen en tres clases:
La recombinación homóloga, intercambio genético entre dos moléculas de DNA que comportan una región de secuencia casi idéntica.
 La recombinación específica de sitio, los intercambios sólo tienen lugar en una secuencia de DNA particular.
 La transposición normalmente interviene un segmento corto, con capacidad de trasladarse de un lugar. Son genes saltarines.
 Recombinación homóloga: En bacterias es un proceso de reparación del DNA, en eucariotas está asociado a la división celular y a la reparación del DNA. Según el modelo de Holiday, dos secuencias homólogas tienen que aproximarse y alinearse, luego se produce una rotura sencilla, en una sola hebra, y un entrecruzamiento entre las hebras cortadas, es el llamado intermediario de Holliday. Después, la DNA ligasa une los segmentos.
A continuación, el punto en el que tenemos las moléculas de DNA unidas va a migrar a través de las secuencias y transmitir información de unas a otras. Después se produce una isomerización en ela que la molécula gira y cortes transversales que no producen recombinación y forman un heterodúplex y longitudinales que si producen recombinación. Para finalizar el proceso la DNA polimerasa repararía cualquier hueco y la DNA ligasa unirá los cortes.
Recombinación específica de Sitio.
Tienen lugar en todas las células pero sus funciones varían según la especie, entre ellas está: la regulación de la expresión de ciertos genes o la promoción de reordenamientos programados, o en los ciclos de replicación de algunos virus y plásmidos. Todos consisten en una enzima denominada recombinasa y una
Secuencia única de DNA corta sobre la que actúa la recombinasa. Reconoce y se fija
A cada uno de los dos sitios de recombinación en dos moléculas diferentes de DNA. En cada sitio se corta una cadena de DNA en un punto específico, la recombinasa queda unida covalentemente al DNA en el sitio de corte mediante un enlace fosfotirorina. Las hebras de DNA cortadas se unen a nuevas hebras formando un intermedio de Holliday con nuevos enlaces fosfodiéster, creados a expensas de la unión proteína-DNA. Para completar la reacción el proceso se ha de repetir en un segundo punto dentro de cada uno de los dos sitios de recombinación. El intercambio es siempre reciproco y preciso. Los sitios de recombinación son generados una vez completada la reacción. La recombinasa puede considerarse a la vez como una nucleasa específica de sitio y una ligasa. Si los dos sitios recombinantes están en la misma molécula, la reacción da lugar a la delección o a la inversión del DNA limitado por ellos, en funciones de si los sitios tienen la misma u opuesta dirección. Si los sitios están en moléculas de DNA diferentes o ambos son circulares se produce una inserción.
Transposición
Los transposones son segmentos de DNA presentes en todas las células que se mueven de un lugar del cromosoma a otro, la nueva localización es elegida más o menos al azar, si cayera en un cromosoma esencial, podría matar la célula. Las bacterias tienen dos tipos de transposones:
 Las secuencias de inserción o transposones simples, contienen las secuencias requeridas para la transposición y los genes para las proteínas que promueven el proceso.
 Los transposones complejos contienen genes, además de los necesarios. Pueden, por ejemplo, conferir resistencia a los antibióticos.
La mayoría tienen cortas secuencias repetitivas en cada extremo, que sirven de sitios de unión de trasposasa. Cuando ocurre la transposición una secuencia del sitio de inserción se duplica para formar una corta secuencia repetida adicional que flanquea cada extremos de transposón insertado.
Otra clasificación es teniendo en cuenta el tipo de codificación y si codifican transposasa o sorbosa, (transposasa que reconoce un tipo específico de secuencias).
 Clase I: simples, sólo tienen transposasa hay de dos tipos:
 Secuencia de inserción: el gen de la transposasa está flanqueada por secuencias repetidas e invertidas.
 Transposones compuestos, un gen que codifica para otra flanqueada (rodeada) por secuencias de inserción.
 Clase II: tenemos secuencias cortas que flanquean el elemento transponible y en el centro hay 3 genes, una para la transposasa, otro para la resobasa y otro.
 Clase III: Se encuentran en bacteriófagos, se integra el genoma en la célula huésped y siempre tiene un gen A para transposasa, un gen B que hace la transposición más rápida y otros que codifican proteínas estructurales.
Cuando se insertan en un cromosoma lo hacen mediante cortas secuencias en el genoma huésped para acoplarse a él. Siempre que se integra el transposín la secuencia se duplica porque la transposasa hace un corte escalionado. Una vez que ha cortado el DNA se integra el transposón que se flanquea por la secuencia diana.
En la transposición simple o directa el transposón es escindido ( separado) por cortes en ambos extremos y el transposón se mueve. Este proceso deja una rotura de cadena doble en el DNa donador. En el lugar de la inserción se produce un corte indentado, el transposón es insertado en la rotura y la replicación del DNA llena el hueco.
En la replicativa se replica el transposón completo dejando atrás una copia en el donador. El cointegrado es un intermedio de este proceso, consiste en la región dadora unida covalentemente al DNA del receptor. El cointegrado hay dos copias completas del transposón, ambas con la misma orientación relativa en el DNA.
Lesiones en el DNA y Mutaciones
Los cambios pueden producirse de forma espontánea, por mal funcionamiento de la polimerasa, por agentes ambientales o por agentes químicos.
Los agentes químicos pueden ser:
Nitritos, precursores del ác nitroso, llevan a cabo la desaminación de las bases, sufren modificaciones e incluso convertirse en otras bases distintas.
 Agentes Alquilantes, pueden producir cambios en apareamientos de ases. Mimetizan las bases, hacen que una se transforma y actúe como otra base.
 Agentes Químicos que producen Desporinaciones, hidrólisis del enlace N-β-glucosídico, rompen el enlace que une la base con la pentosa.
 Agentes oxidantes, pueden aparecer por radiaciones o por mal funcionamiento del metabolismo. Rotura de DNA.
Las mutaciones son cambios en la secuencia, permanentes y heredables. Pueden ser:
 Puntuales:
 Transiciones, se cambia una purina por una purina o pirimidina por pirimidina
 Transversiones, se cambia una base púrica por una pirimidinica.
 De cambio de Sentido, cambian el aa codificado.
 Sin sentido, generan un codón de terminación.
 Silenciosas, no afectan a DNA esencial o tienen efecto despreciable.
 Inserciones Y delecciones afectan a fragmentos. En las inserciones se añaden y en las delecciones se quitan. Afectan al marco de la lectura.
El mecanismo por el que se produce la transición de forma espontánea fue definido por Watson y Crick. Observaron que hay bases que cambian el estado de sus enlaces porque los átomos de H cambian su posición y forman tautómeros. Estos hacen que un apareamiento se pueda modificar de forma transitoria. Cuando se tautomeriza, una base, puede aparearse con una base distinta.
En los mamíferos hay correlación entre el cáncer y las mutaciones por lo que se aplicó el test de Ames para determinar si un agente es mutagénico o no.
Con una cepa de salmonella mutante que no es capaz de sintetizar histidina y solo es capaz de crecer en un medio con histidina. Se expone la cepa a supuestos agentes mutagénicos para que modifiquen el gen que no permite la síntesis. Luego pondrán las cepas en un medio sin histidina y con el agente mutagénico, si aparecen colonias es que ha activado el agente mutagénico.
Ames hizo 4 experimentos, en el 2º,3º y 4º depositó el agente en diferentes concentraciones. En el que más concentración, las colonias nacían lejos del disco. A concentraciones muy elevadas es letal.
Para conseguir que los agentes actúen en condiciones similares a seres vivos se añade a las cepas homogeneizado de hígado de rata, ya que muchos agentes mutagénicos son cancerígenos en contacto con sustancias del hígado.
Reparación
 Reparación por escisión de dímeros de pirimidina o nucleótidos: El más frecuentemente son los dímeros de T, se producen cuando las células están expuestas a rayos UV. La consecuencia es que la estructura del DNA queda bloqueada y no puede transcribirse ni replicarse.
En E coli el complejo enzimático clave es la ABC excinucleasa. Está formado por tres subunidades, UvrA, UvrB y UvrC. UvrA y UvrB efectúa un barrido del DNA y se une al lugar de la lesión. A continuación, el dímero de UvrA se disocia, dejando UvrB unida al DNA, UvrC se une a UvrB que realiza una escisión en el quinto enlace fosfodiéster en el lado 3’ de la lesión. UvrC efectúa una escisión en el octavo enlace fosfodiéster en el lado 5’. El hueco es rellenado por la DNA pol I y la DNA ligasa.
 Reparación por fotoreactivación: Reacción promovida por las DNA fotoliasas. Los dímeros de pirimidina son el producto de una reacción inducida por la luz y las fotoliasas utilizan energía procedente de la luz para invertir la lesión.
Reparación por escisión de base: Todas las células contienen DNA glucosilasas que reconocen lesiones y eliminan la base afectada rompiendo el enlace N-glucosilo. El resultado es un sitio apurínico o apirimidínico conocidos como sitios AP.
El más común es la desaminación de la C para obtener U que es eliminado por la uracilo glucosilasa. Una vez formado el sitio AP, otro grupo de enzimas ha de repararlo. La desoxirribosa 5’-fosfato es eliminada y reemplazada por un nuevo nucleótido. Las AP endonucleasas cortan la cadena que contiene el sitio AP; a continuación se elimina un segmento de DNA que contiene el sitio AP, este es reemplazado por la DNA polimerasa I y sellada por una DNA ligasa.
T y U únicamente se diferencian en el C5, la T está metilada. Si tuviésemos U en lugar de T en el DNA, el U se confundiría con la C desaminada y no se eliminaría correctamente una mutación.
 Reparación de apareamientos incorrectos: Se corrigen con la información contenida en la cadena molde, el sistema discrimina la cadena recién sintetizada. La célula consigue este objetivo marcando el DNA molde con grupos metilo.
La discriminación se basa en la acción de la Dam metiliasa que metila el DNA en la posición N6 de todas las adeninas presentes en la secuencia GATC.
La proteína MutL forma un complejo con la Mut S y se une a todos los pares mal apareados. La Mut H se une a la proteína Mut L y a las secuencias GATC que haya encontrado el complejo MutL- MutS. El paso del DNA a ambos lados del apareamiento incorrecto a través del complejo MutL-MutS forma un bucle de DNA. La proteína Mut H es una endonucleasa con especificidad de secuencia, que se mantiene inactiva hasta que el complejo encuentra una secuencia GATC semimetilada. En estos lugares, MutH cataliza el corte de la cadena no metilada por el lado 5’ de la G en GATC, marcando de este modo la hebra que se ha de reparar. Cuando el desapareamiento se encuentra en el lado 3’ del sitio de corte, la hebra
Sin metilar es desenrollada y degradada en dirección 3’-5’, a partir del sitio de corte hasta más allá del desapareamiento, siendo después reemplazada por nuevo DNA. Este proceso requiere la acción combinada de la DNA heliclasa, SSB y exonucleasa I
Síntesis de DNA propensa al error o respuesta SOS
A falta de una segunda hebra que pueda guiar la reparación, la información requerida debe proceder de un cromosoma homólogo separado. Depende, de la recombinación genética homóloga. Proceso denominado Reparación del DNA por Recombinación. Cuando las lesiones se producen en una cadencia inhabitualmente rápida se activa una nueva ruta, conocida como reparación propensa a error. Cuando este mecanismo está activado, la reparación del DNA es mucho menos precisa, aumentan la tasa de mutación. La reparación propensa al error es parte de la respuesta celular, al estrés causado por daños extensos y se conoce como respuesta SOS.