Aislamiento, Purificación Y Secuenciación de Ác Nucleicos

Tema 15, Aislamiento, Purificación Y secuenciación de Ác Nucleicos.
Fraccionamiento de los Ác Nucleicos
Lisado celular y obtención del extracto crudo.
Desproteinización mediante agitación suave con:
Una disolución con fenol y/ o una mezcla de cloroformo u alcohol isoamilico, que son inmiscibles, no solubles en agua, al mismo tiempo que desnaturalizan las proteínas.
Con detergentes.
Con cloruro de guadinilo o sal.
Con proteasas
Obtendremos una fase acuosa, una capa lipídica y una fase orgánica con proteínas.
Se han de precipitar los ác nucleicos con etanol, estos precipitan como una hebra blanca.
Si queremos separar DNA de ARN utilizaremos DNAasa y RNAsas.
Las técnicas cromatográficas son aplicables para la separación de ác nucleicos.
Cromatografía de hidroxiapatito tiene gran afinidad por los ác nucleicos, que se despegan del mismo mediante eluciones de tampón fosfato En primer lugar
Eluiran las proteínas, después el RNA, después el ADN monocatenario y
finalmente el ADN bicatenario.
 Centrifugación en Grandiente.Se hace en gradiente de cloruro de cesio, y obtendremos en gradiente de densidad, de modo que los ác nucleicos con más densidad se quedarán abajo. Se aplica para separar DNA satélite en eucariotas, plásmidos en proceriotas y DNAs en monocatenarios.
 Técnicas Electroforéticas en función de su tamaño podemos separar los ác nucleicos mediante dos geles. Uno de ellos forma un entramado por el que se mueve los ác nucleicos de distinto tamaño. Las moléculas más pequeñas se moverán más rápido que las más grandes de los pocillos al ánodo.
Para visualizar los ác nucleicos se utiliza el bromuro de etidio, cancerígeno, o el SYBR green, moléculas que se intercalan entre las bases nitrogenadas y tienen fluorescencia. En cada bando fluorescente que podemos observar hay muchas hebras de DNA de igual tamaño. EL polímero puede ser la agarosa, para las moléculas de mayor tamaño, en la horizontal o la poliamida, para las de pequeño tamaño utilizada en la vertical.
Transferencia de Southern Blotting
Es una hibridación en la que se lleva a cabo un emparejamiento entre una hebra de un gen de DNA con una hebra de DNA marcado.
Se utiliza para el DNA pero también están las transferencias de Northen, que transfieren ARN y las Western que transfieren proteínas.
1-Los fragmentos de DNA se separan en función de su tamaño por electroforesis en gel de agarosa.
2-Los fragmentos de DNA se desnaturalizan por inmersión en gel de álcali.
3-Se transfieren a una membrana de nailon o nitrocelulosa para reproducir la distribución de fragmentos del gel.
4-Se sumerge la membrana en una disolución con una sonda de DNA marcada con radioactividad.
5-Cuando se encuentran con la región complementaria de la senda se hibridan con ella.
6-Se reconocen los fragmentos por autorradiografía. La sonda va a emitir energía que se proyectará en la radiografía.
Las nucleasas son enzimas que degradan los ác nucleicos hidrolizando el enlace fosfodiéster. Son poco específicas y hay 2 tipos según si degradan los ác nucleicos desde los extremos, exonucleasas o si hidrolizan los enlaces desde el interior, endonucleasas. Actúan sobre DNAs bicatenarios.
Hay un tipo que son muy específicos, las Enzimas de Restricción, abundantes en bacterias, que las utilizan para protegerse de la entrada de ác nucleicos extraños. Digieren DNA y lo que hacen las bacterias para que no se autodigiera es metilar las secuencias que reconocen las enzimas de restricción. La enzima que realiza la metilación es la metilasa. Existen 3 tipos de Endonucleasas de Restricción.
Tipo I, enzimas de gran tamaño compuestas por subunidades, una que metila y otro que actúa contra el ADN, corta el DNA a unos 1000pares de la secuencia de reconocimiento, requiere de energía.
Tipo II, cortan en un punto dentro de la cadena de reconocimiento, tienen actividad endonucleasa y no requieren energía.
 Tipo III, son similares a las del tipo I, pero en lugar de cortar a 1000p de bases cortan a 25. Requieren energía para realizar la digestión del ADN.
Las enzimas de restricción reconocen secuencias cortas palindrómicas, su nomenclatura se basa en el organismo en el que se han encontrado, 3 letras en cursiva del nombre del organismo. Algunas endo de restricción realizan cortes en las dos hebras del DNA, que dejan de dos a cuatro nucleótidos desapareados en cada extremo. Se los conoce como extremos cohesivos, pueden aparearse entre si o con extremos cohesivos complementarios de otros fragmentos de ADN. Otras cortan ambas cadenas en los enlaces fosfodiéster opuestos, de modo que no dejan bases desapareadas, son los extremos Romos.
Los mapas de restricciones muestran las posiciones de los puntos de corte de diferentes enzimas, tendremos un mapa diferente para cada enzima.
Amplificación de una Secuencia De DNA Específica, Técnica PCR, reacción en cadena de la polimerasa.
Técnica que permite incrementar artificialmente la cantidad de un DNA que se encuentra en baja cantidad. Esta técnica tiene dos fundamentos:
 La capacidad del DNA para desnaturalizarse y renaturalizarse.
 La DNA polimerasa es termoestable.
Se separan las cadenas de DNA por calentamiento.
A continuación se hibridan con un exceso de cebadores de DNA que flanquean la región que se desea amplificar.
Se repite el proceso unas 30 veces.
Los cebadores son pequeñas moléculas de DNA complementarias a la secuencia. Tienen que estar por delante o por detrás de la secuencia que se quiere utilizar. Las piezas que se añaden son dNTP.
La técnica detecta y amplifica una molécula de DNA en muchas, es muy sensible y específica. Antes de realizarla se somete la muestra a una elevada Tª y se da una etapa de prolongación para asegurar que todos los fragmentos obtenidos están completos.
Secuencia de Ác nucleicos
Se sigue la misma estrategia que con las proteínas:
El DNA se va a degradar parcialmente para obtener fragmentos más pequeños.
Secuenciación de los fragmentos individuales por algún método.
Ordenación de los fragmentos en función de su tamaño.
Método de Sanger 1977
La separación de las hebras se observa en el gel con la diferencia de un solo nucleótido. Se basa en la reducción del DNA en 4 conjuntos de fragmentos marcados de forma específica para cada base. La DNA polimerasa utilizada es de E. coli la cual sintetiza copias complementarias del DNA que se secuencia. Esta tiene actividad exonucleasa (elimina nucleótidos) y actividad polimerasa, que es el fragmento Klenaw (copia nucleótidos). Para llevar a cabo se necesita:
La hebra modelo.
DNA polimerasa.
dNTPs, marcados radiativamante o con dogoxigenina.
Un cebador.
Análogo de los dNTPs, 2’-3’- desoxinucleótidos trifosfato (dd).
Sirven para anular la elongación de la cadena, ya que impide la formación de enlaces fosfodiester. Existe uno para cada base nitrogenada.
La secuencia obtenida con este método es la complementaria de la que realmente se busca.
Secuenciación Automática de ADN
Características:
Dideoxinucleótidos. Cada uno está marcado con fluoróforos que emiten luz de diferentes colores (fluorescencia).
Permite obtener secuencias de miles de nucleótidos en pocas horas.
Los 4 ddNTPS se añaden en el mismo tubo.
Las electroforesis se realizan en un único gel con un tubo capilar o en una lámina muy fina
Los colores se detectan con un laser.
Por último se obtiene un fluorograma, donde cada pico y color corresponde a una base.