Transcripción del DNA y Maduración

Tema 17, Transcripción del DNA y Maduración.
El DNA tiene que pasar a ser RNA para sintetizar proteínas. La transcripción es el proceso. Se parece a la replicación en su mecanismo, la polaridad y la utilización de un molde. La transcripción tiene fases de inicio, elongación y terminación. No requiere cebador y está limitada a cortos segmentos de la molécula de DNA. Además, dentro de los segmentos transcritos sólo una de las hebras del DNA sirve de molde. La transcripción se centra en un solo gen o en un grupo de genes.
La RNA polimerasa dependiente de DNA
Requiere cuatro ribonucleótidos 5’-trifosfato (ATP, GTP, UTP y CTP como precursores de los nucleótidos, así como Mg2+. La RNA pole longa una cadena de RNA y sintetiza el RNA en dirección 5’3’.
La pol requiere DNA para su actividad, siendo más activa con un molde de DNA bicatenario, solo se utiliza una de las dos hebras. La hebra molde es copiada en dirección 3’-5’. Cada nucleótido en el RNA recién formado se selecciona según las interacciones de apareamiento de bases de Watson y Crick; los residuos de uridilo se insertan en el RNA para aparearse con adenilato en el DNA molde. La RNA pol no requiere un cebador.
Las dos hebras de DNA tienen papeles diferentes. La hebra que sire de molde se denomina hebra molde. La hebra complementaria del molde, la hebra no molde o codificante, es idéntica en secuencia de bases al RNA, con U en lugar de T. La secuencia puede estar situada en cualquier de las hebras.
La RNA pol dependiente de DNA es una enzima compleja y de gran tamaño con 5 subunidades núcleo y otra perteneciente al grupo σ. La subunidad σ se une transitoriamente al núcleo y dirige la enzima hacia sitios específicos de unión en el DNA. Estas seis subunidades constituyen la holoenzima según el tipo de subunidad σ. La más común es σ70.
Las RNA pol carecen de actividad exonucleasa 3’-5’ correctora de pruebas.
El inicio en puntos al azar sería un proceso sumamente antieconómico, por ello la RNA polimerasa se une a secuencias específicos denominados PROMOTORES, las cuales dirigen la transcripción. Las secuencias son idénticas pero los que se encuentran con mucha más frecuencia forman una secuencia consenso. La secuencia consenso en la región -10 es TATAA 5’-3’; la secuencia en la región-35 es TTGACA 5’-3’. Un tercer elemento rico en AT, denominado elemento UP se encuentra en los promotores de genes con un nivel de expresión elevado entre -40 y -60. La eficacia y el inicio de la transcripción en un promotor de pende en buena medida de estas secuencias, del espaciado y de la distancia del sitio de inicio de la transcripción.

Etapas de la Transcripción.
Inicio: Se produce cuando la RNA pol se une a los promotores. El grupo 5’-trifosfato del primer residuo de una cadena nueva no es cortado para liberar PPi, sino que se mantiene intacto durante toda la transcripción. Primero se une a la secuencia de -35 y desenrolla en la región de -10 una secuencia de 17 pares de bases rica en T y A. Cuando las dos hebras se separan se forma un Complejo Abierto en el que comienza la síntesis de RNA.
Cuando la pol se une al DNA pierde el factor σ se acopla únicamente a la hebra molde cuando va a comenzar. El σ estándar es el σ70 pero en E coli hay muchas más como σ32 que se sintetiza cuando se somete a una elevada temperatura.
En ocasiones hay otras secuencias promotoras a las que se unen proteínas que activan o inhiben. Si en las regiones promotoras se dan mutaciones el gen será erróneo y habrá modificaciones en la transcripción.
Elongación: Comienza después de la formación del primer enlace fosfodiéster. La pol no tiene factor σ, ahora irá leyendo la secuencia molde y sintetizado el RNA. El extremo en crecimiento de la nueva cadena de RNA se aparea temporalmente con el DNA molde para formar una doble hélice híbrida de una longitud de ocho pares de bases. EL RNA en este dúplex híbrido se despliega y se restablece el dúplex de DNA. La elongación se llevará a cabo hasta que haya unas secuencias que indiquen que ya ha acabado, se encuentran en el RNA transcrito.
Terminación: E coli posee al menos dos clases de señales de terminación, una clase actúa mediante un factor proteico ρ mientras que la otra es independiente de ρ. (rho)
 La clase independiente de ρ tiene dos rasgos distintivos. El primero es una región cuyo transcrito de RNA tiene secuencias autocomplementarias que permiten la formación de una estructura en horquilla cortada 15 a 20 nucleótidos antes del final de la hebra de RNA. El segundo rasgo es una serie de adinelatos en la hebra molde que se transcriben como uridilatos en el extremos 3’del RNA. Cuando la polimerasa llega a un sitio de terminación se detiene. La formación de la estructura en horquilla puede desorganizar la interacción entre el RNA y la RNA pol facilitando la disociación del transcrito.
 Los dependientes de ρ carecen de la secuencia de adenilatos repetidos en la hebra molde, pero tienen una secuencia corta que se transcribe formando una horquilla. La proteína ρ se une al RNA en sitios específicos y migra en la dirección 5’-3’ hasta encontrar el complejo de transcripción detenido en el sitio de terminación. Contribuye a facilitar la liberación del transcrito, la proteína ρ posee actividad RNA-DNA heliclasa dependiente de ATP, que promueve la translocación de la proteína.
RNA polimerasas Eucarióticas
Tienen tres RNA polimerasas, complejos distintos con subunidades en común:
 La RNA pol I es responsable de la síntesis de un solo tipo de rRNA 18s, 5.8s y 28s.
 La principal función de la RNA pol II es la síntesis de mRNA y de algunos RNA especializados. Reconoce miles de promotores cuyas secuencias pueden diferir. Muchos promotores reconocidos tienen características comunes entre las que se encuentra la secuencia TATAA cerca del par de bases -30 y una secuencia Inr iniciador, cerca del inicio de transcripción.
 La RNA pol III produce tRNA, el rRNA5s y algunos otros RNA especializados de pequeño tamaño, los promotores reconocidos por la RNA pol III están bien caracterizados.
La RNA pol II tiene promotores específicos en la región de -25. Está la caja TATA con 6 pares de bases TATAAA, en este punto empezará a formar la burbuja de replicación. A continuación estará la caja GC y la caja CAAT.
Inhibición de la Transcripción
Casi todos los inhibidores son antibióticos que inhiben la actividad de la pol.
 En procariotas:
Rifamicina B y rifampicina, inhiben la síntesis de RNA al unirse a la subunidad β de las RNA pol, impidiendo el desalojo del promotor.
Cordicepina, inhibe la elongación.
 En eucariotas:
α amanitina, impide la formación de mRNA en las células animales al bloquear la RNA pol II y a altas concentraciones también la III.
 Comunes:
Actinomicina D que inhibe la elongación; la porción plana de esta molécula se intercala en el DNA deformándolo e impidiendo el paso de la pol.
Daunomicina y adrianomicina, se unen al DNA bicatenario e impiden que se formen las burbujas de transcripción y replicación.
Maduración del RNA
Todas las RNA son modificadas después de su síntesis, las Ribozimas que catalizan están constituidas por RNA.
Una molécula de RNA recién sintetizado se denomina transcrito primario. Los fragmentos que interrumpen la región codificante son los intrones y los codificantes exones. En el splicing los intrones son eliminados del transcrito primario y los exones son unidos para forman una secuencia que especifique un polipéptido funcional. Un residuo modificado denominado casquete en 5’ es añadido en el extremo 5’, el extremo 3’ es cortado y se añaden unos 80 a 250 residuos de adenilato para formar una cola de Poli A.
 Eliminación de intrones, sólo se encuentran en eucariotas, arqueas y virus. Los intrones tienen motivos estructurales comunes, todos empiezan por GU, en el 5’ y acaban por AG en 3’; además, aparece un centro de ramificación, a unos 20 nucleótidos. Existe un mecanismo general de splicing:
En primer lugar se produce una rotura de un enlace fosfodiéster en el punto de empalme 5’ por hidrólisis provocada por un ataque neofílico del extremo 2’hidroxilo de un residuo de adenina en el centro de ramificación para crear un enlace fosfodiéster entre esa adenina y la guanina del punto de empalme del intrón, se forma un enlace 2’-5’. A continuación el extremo 3’ del exñon 1 va a reaccionar en el punto de empalme 3’ del intrón, generándose un enlace entre el exón 1 y el 2 y el intrón queda libre con una estructura de enlace σ.
El corte y empalme requiere la acción de complejos RNA-proteína especializados, denominados pequeñas ribonucleoproteínas nucleares SnRNP. Cada SnRNP contiene un RNA de 100 a 200 nucleótidos de RNA eucariónticos llamados pequeños RNA nucleares SnRNA- En los núcleos eucarióticos se encuentran cinco SnRNA ( U1,U2, U3, U4, U5, y U6) implicados en las reacciones de corte y empalme.
El SnRNA U1 contiene una secuencia complementaria de secuencias próximas al sitio 5’ de corte y empalme de los mRNA nucleares con la que la SnRNP U1 se une a esta región del transcrito primario. La adición de las SnRNP U2, U4, U5 y U6 conduce a la formación de un complejo de corte y empalme llamado espliceosoma, dentro del que tiene lugar la reacción de corte y empalme.
Al transcrito primario se le une la SnRNP U1 en el centro de empalme 5’ del intrón. Posteriormente se une la SnRNP U2 al centro de ramificación, al residuo de adenina con el gasto de ATP. Después, la unión de un complejo de SnRNP U4 y U5 da lugar al esplieceosoma en el que los residuos de A y B se quedan muy próximos. Requiere ATP, una vez formado el espliceosoma se eliminan los intrones y cuando este se separa, los exones quedan unidos.
Ciertos tipos de RNA son capaces de eliminar sus propios intrones sin moléculas extra, se le denomina autosplicing. Se observó en un protozoo y en ciertos rRNA de cloroplastos de unicelulares y en mitocondrias de levaduras y hongos. Existen distintos tipos de mecanismos que difieren en la naturaleza del atacante que rompe el enlace entre en intrón y el exón. Existen dos tipos, los del tipoI, que tienen como grupo atacante un grupo extra de guanosina, y los del tipo II tienen como grupo atacante la adenina.
El cofactor de guanosina forma un intermediario con el extremo 5’ del intrón.
En las de Tipo II y en el espliceosoma el intrón se elimina en forma de lazo, en el tipo I el intrón se libera en forma lineal, pues el residuo de guanosina se une al extremo 3’ del intrón.
Modificaciones en el RNA
Modificaciones en mRNA
En eucariotas, los mRNA maduros tienen rasgos estructurales distintivos. La mayoría tiene un casquete en 5’, un residuo de 7-metilguanosina unido al residuo 5’-terminal del mRNA a través de un enlace 5’,5’-trifosfato. En el extremo 3’ la mayoría de mRNA tienen una serie de 80 a 250 residuos de adenilato, denominada cola de poli a.
Existen modificaciones, en el 5’ se produce una adición de Z-metilguanosina mediante un enlace 5’-5’-trifosfato. Se una el residuo de guanosina y se produce una metilación. El residuo del final es CAP 5’, si sólo se metila la guanosina CAPO, si hay además una ribosa metilada CAP1, si hay dos CAP2. El CAP 5’ se añade una vez transcritos 20 nucleótidos, protege el transcrito del ataque de fosfatasas y nucleasas.
En el extremo 3’ se adiciona la cola de pola A de 20 a 250 adenilatos que no vienen codificados en el DNA, se añaden de forma extra. En el transcrito primario existe una secuencia de 6 nucleótidos reconocida por una endonucleasa, se une y elimina todo el RNA que se encuentra a unos 20-30 nucleótidos de la secuendcia diana. Ahora actúa la poliadenilato polimerasa que utiliza ATP como fuente de adenilato para añadir residuos de A en el extremo de entre 30 y 250, utiliza como cebador la molécula de mRNA anterior al extremo OH.
Maduración de los rRNA y tRNA
Los RNA ribosómicos se forman a partir de precursores más largos denominados RNA prerribosómicos, se transcribe una secuencia completa de RNA, se eliminan los intrones y se transcribe cortando las secuencias para sintetizar los rRNA.
Los precursores de tRNA (imagen) pueden ser modificados. El trinucleótido 3’-terminal CCA 3’ está ausente y es añadido durante el procesamiento por la tRNA nucleotidotransferasa, que une los tres ribonucleósidos trifosfato precursores en sitios activos separados y cataliza la formación de los enlaces fosfodiéster para producir la secuencia CCA 3’. La etapa final del procesamiento del tRNA consiste en la modificación de algunas bases.
Diferencias:
En eucariotas la trancripción tiene lugar en el núcleo y la traducción en el citoplasma
En procariotas todo ocurre en el mismo lugar permitiendo que sean simultáneos.
Transcriptasa inversa:
Ciertos virus contienen dentro de la partícula vírica una DNA pol denominada Transcriptasa inversa. Durante la infección, la RNA mocohebra y la enzima penetran en la célula huésped. La retrotranscriptasa cataliza la síntesis de una cadena de DNA complementaria del RNA vírico, y degrada la cadena de RNA del híbrido RNA-DNA y lo reemplaza con DNA. El DNA dúplex queda incorporado en el genoma de la célula huésped. Estos virus son llamados retrovirus.
Han jugado n papel importante en el avance del conocimiento molecular sobre el cáncer. La mayoría no matan a sus células huésped, sino que permanecen integrados en el DNA celular y se replican con el mismo. Algunos contienen un oncogén que provoca que la célula crezca anormalmente.
El VIH es un retrovirus. El VIH mata muchas de las células que infecta principalmente linfocitos T.