Cinética E Inhibición Enzimática

Tema 8 Cinética E Inhibición Enzimática
Encargada del estudio de las velocidades. Leonor Michaelis 1875 y Maud Menten 1879 purificaron ciertas enzimas para observar su funcionamiento y velocidades. Uno de los factores que afectan es la cantidad o concentración de S presente. Esta cambia durante el transcurso a medida que se convierte en producto. Añadían a un tubo de ensayo más sustrato y estudiaban la velocidad, como de rápido desaparecía el sustrato y aparecía el producto. Elaboraban una gráfica en el eje de abscisas de S y en las ordenadas la velocidad en los instantes iniciales [S] es mayor que la de enzima. Se puede observar el efecto de [S] sobre vo cuando se mantiene constante la concentración de enzima. A mayores concentraciones de S vo aumenta cada vez menos hasta que se alcanza un punto en el que incremento de vo es pequeñísimo.
A partir de estas representaciones se obtienen dos parámetros
Vmax, velocidad más elevada y km concentración de sustrato
Que requiere para que la velocidad sea la mitad de la máxima.
Nos da idea de la afinidad, cuanto más pequeña, mayor afinidad.
En 1903, Víctor Henri propuso que una enzima se combina con su S
formando el complejo ES como paso necesario. Fue ampliada por
Michaelis y Menten en 1913 quienes postularon que se combina en primer lugar de forma reversible.
El complejo ES se descompone en un segundo paso más lento dando el enzima libre y el producto.
K1 y k2 son las constantes de equilibrio.
En una reacción catalizada la E está en dos formas, la forma libre E y la combinada ES. A baja S la mayor parte de E estará libre. Aquí las velocidad será proporcional a S. La Vmax se observará cuando toda la enzima esté como ES y la concentración de E sea pequeña. El E está saturado de modo que el aumento de S no tiene efecto. Cuando ES se descompone dando el P la enzima queda libre para catalizar otra reacción. Cuando la enzima se mezcla con un gran exceso de sustrato, existe un periodo ESTADO PRE-ESTACIONARIO durante el cual aumenta la concentración de ES. Alcanza rápidamente un estado ESTAIONARIO en el que ES permanece constante, porque a medida que se libera el producto la enzima va captando sustrato.
Ecuación Michaelis-Menten
Partieron de que el paso limitante de velocidad es la descomposición del complejo ES. En un momento de condiciones saturantes habrá poco producto. En estas condiciones el sistema alcanzaba el equilibrio rápidamente, lo que llamaron Cinética de Equilibrio Rápido. En condiciones de saturación del sustrato llega un momento en la reacción en que la concentración del intermedio de reacción se mantienen constante Cinética de Estado Estacionario. Siendo muy abundante el sustrato, el equilibrio se alcanza rápidamente y la probabilidad de que la reacción sea reversible es nula.
Las velocidades de formación y descomposición han de ser iguales.


Linewearer y Burk aplicaron a la gráfica de Michaelis Mentel una doble inversa, 1/vo y 1/s, así conseguimos una recta y sea más sencillo calcular vmax y km ya que son los puntos en los que corta en los ejes. El punto que corta en la ordenada es 1/vmax y el que corta en la abscisa es -1/km.
La constante catalítica kcat es el número mo molec. De S que pasan a producto en una unidad de tiempo por una enzima cuando está saturada. Nos da idea de la eficacia.
En condiciones saturantes de S la kcat define la velocidad limitante porque se favorece hacia la derecha y el complejo ES se forma a la misma velocidad que se descompone dando producto.
Para hacer una comparación se utiliza kcat/km porque define que enzima es más rápida utilizando menos producto. En Michaelis mentel k2 es limitante, así k2
Inhibición Enzimática
Es el conjunto de procesos que bloquean la actividad, reversibles que se unen a la enzima impidiendo su actividad y pudiendo disociarse e irreversibles que se unen y nunca se disocian.
Reversibles: Según la forma en la que actúan.
Inhibición Competitiva: Compite con el sustrato por el
centro activo pero la reacción no tiene lugar cuando se
ha fijado el inhibidor. Mientras ocupa el centro activo
impide la fijación. El incremento de [I]da lugar a líneas
con una intersección común en el eje 1/vo pero con
pendientes diferentes. 1/vmax es la misma pero la km es mayor
con inhibidor.
Inhibición incompetitiva Se une a la enzima en un punto
diferente y lo hace siempre aunque se haya unido ya el sustrato.
Las rectas que obtenemos tienen distintos valores de Vmax y km.

Inhibición no competitiva: Se fija a un sitio distinto,
No bloquea la fijación del sustrato. Se inactiva cuando
Está fijado el inhibidor tanto si está el sustrato presente
como si no.
Irreversibles: Son moléculas que se unen permanentemente
se combinan covalentemente con un grupo esencial para
su actividad o lo destruyen. El diisopropil fluorofosfato
DIFP es un buen inhibidor de Serin-proteasas como la
quimotripsina que se une covalentemente a la serina e
impide que se unan a un sustrato.
Reacciones Bisustrato
Hay enzimas capaces de interaccionar con dos sustratos a la vez, implican la presencia de un átomo o un grupo funcional de un sustrato a otro. Transcurren por varias rutas, a veces ambos sustratos están fijados a la enzima y formando un complejo terciario. Algunas actúan de forma aleatoria, la condición es que finalmente se forme el complejo terciario que dará lugar a dos productos. Otras siguen un mecanismo ordenado, inicialmente tenemos una enzima libre, se une a un S1 para formar un complejo binario ES1, en este momento se une el S2 para formar el complejo ternario ES1S2 y dar lugar a P1 y P2.
Ej. Piruvato+NADH lactato----- E+ NADH E (NADH) + Piruvato ENADH Piruvato
Hay enzimas capaces de interaccionar con dos sustratos sin formar un completo terciario. La enzima libre se une a S1 para formar ES1 que evoluciona para dar lugar a EP1 se libera el P1 y entonces se une el S2. Son reacciones en cadena que una depende de la otra, si el P1 no se libera, no se puede unir el S2.
E+S1 ES1 EP1 E ES2 E+P2

Las enzimas son proteínas, su función y estructura se modificará con los cambios de Tª y de pH. Las curvas de pH son campanas de Gauss en las que el punto óptimo está en lo más alto. A partir de las gráficas de pH y Tª se puede obtener la EA mediante representaciones de Anteria, nos centramos en la zona de la curva donde la actividad aumenta. La Tª la representamos en abscisas 103/T en K; en ordenadas se representa el logaritmo de cada actividad, solo en la fase ascendente. De esta forma la curva se transforma en una recta con pendiente negativa que nos sirve para calcular la EA mediante m= -Ea/2,3R donde R = 1.98cal/mol•k.
Cuando obtenemos dos rectas que se cruzan la reacción tiene al menos una etapa que limita la velocidad.