Métodos de purificación de Proteínas.

Tema 6 Métodos de purificación de Proteínas.
Se pueden purificar en función de:
 La solubilidad, intentando pasar de un medio a otro por ejemplo de uno polar a uno apolar.
 El tamaño, en base al peso o al volumen, es un proceso similar al de un colador. Se pueden utilizar resinas.
 La carga, por electroforesis, por desplazamiento según la atracción.
 La afinidad, consiste en utilizar moléculas que se unen de forma específica a la prot. Por ej. La glucosa oxidasa, podemos separarla con un soporte de glucosa.
Proceso de PurificaciónPrimero. Tener claro qué proteína queremos purificar, por qué y cómo. Esto supone un análisis bibliográfico. Se puede llegar a escoger el ensayo más adecuado, rápido y productivo. Si no ha sido estudiada nunca, prima la imaginación y creatividad. También determinaremos de qué organismo queremos.
Segundo. Recoger la muestra y obtener un conjunto a partir de la materia prima y obtener un homologado de las células de la muestra. Tenemos que romper todas las células para liberar todas las sustancias. Esto lo podemos hacer mediante:
>>Homologado de células, mediante una biopsia obtenemos una pequeña porción del tejido y alteramos su estructura para obtener las cel. libres, con una abrasión, rompemos el tej mediante un efecto mecánico (mortero). El siguiente paso es llevar a cabo una centrifugación diferencial.
>> Centrifugación diferencial. Utilizamos una centrifuga que consta de un cuerpo central capaz de girar. Como producto se genera una fuerza que provoca que todas las células salgan despedidas. Las más pesadas son las primeras en caer. Hacemos varias centrifugaciones a diferentes velocidades.
>> Gradiente de sacarosa, se preparan en un tubo de ensayo soluciones con diferentes concentraciones de sacarosa. Estas se inyectan en el recipiente para crear un gradiente, arriba las [] más pequeñas y abajo las más altas. Cuando introducimos la mezcla de células que en función de su densidad descenderán hasta que su densidad sea la misma que la de la mezcla. De esta manera las células poco pesadas quedarán cerca de la superficie. El problema es que para aplicar esta técnica se requiere mucho tiempo y lo que se hace es aplicar una centrifugación.
Tercero. Cuanto ya tenemos las cél seleccionadas se lisan para eliminar todo el contenido citoplasmático, puede ser mediante:
>> Ósmosis, se añaden las cél a un medio hipotónico para producir una presión muy elevada y hacer que la membrana se rompa. Se utiliza en organismos halófitos. Se requiere que dentro de la célula haya una elevada concentración de sal.
>> Choques de temperatura, se aplican temperaturas muy elevadas para que la bicapa lipídica se desestabilice. Mediante este proceso se pueden desnaturalizar las proteínas, por ello sólo es válido cuando sean organismos termófilos.
>> Sonicación, Aplicar ultrasonidos a las cél. La vibración rompe la integridad de la membrana.
>> Prensa francesa, instrumento en el que introducimos las células y las sometemos a una elevada presión. Pasado un tiempo eliminamos toda la presión, hace que el volumen celular se expanda bruscamente y se rompan las membranas.
Obtendremos una solución acuosa con todos los compuestos. Ahora tenemos que determinar qué proceso y para ello debemos tener en cuenta:
>> La solubilidad, saber en qué rango de pH la prot es soluble. Si desarrollamos la purificación a un pH que coincida con su pI la prot se precipita y pierde su actividad, no nos interesa. A pH ácidos se protona y comienza a ser más soluble y a pH básico se desprotona y sigue siendo muy soluble. Al proceso de precipitación de proteínas provocado por el efecto de sales se le conoce como Salting-Out
>> El tamaño o diálisis. Es el primer proceso de una purificación. No purificamos las proteínas sino que las preparamos. La diálisis es un proceso en el que hacemos uso de una membrana semipermeable. En este proceso utilizamos una bolsa de diálisis en la que introducimos la mezcla de prot, la metemos en una solución acuosa que actúa como tampón a pH 2, si cambiamos el pH provocamos una desnaturalización. Se produce osmosis en el que pasan a través de la membrana. Si tiene un tamaño grande la atraviesan todas pero si tiene un tamaño pequeño, las proteínas no podrán pasar y se quedarán en la bolsa de diálisis. Se utiliza para hacer una selección según su tamaño y cambiar la composición de sal en la mezcla.
>> Cromatografías
La elución es un proceso de salida del tampón de la columna. Es igual que en los aa aunque las prot son de mayor tamaño. Si tienen afinidad por la resina quedarán asociadas a ella y las que no eluiran por la columna. Para que eluyan las que tienen afinidad se realizan cambios en el pH que influyen en la carga pero no en la estructura.
 Cromatografía de intercambio iónico
Se utilizan resinas con carga, catiónicas (+) y aniónicas (-).
>>resinas de intercambio catiónico, están cargadas negativamente y hacen que las cargas neg se eluyan y las pos queden adheridas. Si cambiamos la composición del tampón conseguimos que se desprendas. CM-celulosa y CM-agarosa.

>> Resinas de intercambio aionico, cargadas positivamente retienes prot con carga neg. DEAE-celulosa y DEAE-agarosa.
En el desarrollo de la cromatografía usamos un colector que determina en qué medida vamos a ir recogiendo las distintas proteínas que eluyen para que cada una quede separada.
Cromatografía de Afinidad.
La resina del interior tiene asociado un compuesto químico por el cual las proteínas quedan unidas. Separa las prot en función de su especificidad de fijación. Las retenidas se unen específicamente a los ligandos unidos covalentemente a las cuentas.
Cromatografía de Exclusión molecular o Filtración por gel
Separa las prot en función de su tamaño. Las partículas de resina tienen poros dentro de ellas, por ello cuando introducimos la mezcla las primeras que se eluyen son las de mayor tamaño porque atraviesan los poros y las más pequeñas tardan más porque realizan una trayectoria más larga.
Para averiguar el rendimiento elaboramos el cromatograma, una representación del tiempo o volumen frente a la absorvancia a 280nm. El volumen se representa sumado aunque en la de gel se suele representar el tiempo. En la representación cuanto más separados y definidos estén los picos, más clara será la purificación.
Cuando finalizamos es necesario elaborar una tabla con 6 columnas y que contenga:
El nombre de la cromatografía o técnica empleada stop.
La cantidad total de la proteína.
La actividad, concentración del producto de aparece/tiempo.
La actividad específica, concentración de producto que aparece/tiempo. En función de la cantidad.
Rendimiento % de prot que se obtiene.
Nivel de purificación.
También existe una técnica de purificación llamada de Fragcionamiento o precipitación con sales en la que el sulfato amónico, que retiene con mucha afinidad moléculas de agua, capta las mol de solvatación y estas precipitan. Con fases secuenciales de adición se separan las prot para que precipiten la mayoría excepto la muestra. Es un método para eliminar la morralla antes de la cromatografía.
 Cuarto: Electroforesis en gel, procedimiento que permite la separación de moléculas sobre un soporte gracias al empleo de un campo eléctrico. La más usada es la electroforesis en condiciones desnaturalizantes en gel de poliacrilamida que utiliza el SDS, sodio-dodecil-sulfato. Para determinar la efectividad o velocidad v=Ez/f=μ, se deben tener en cuenta las fuerzas E la carga neta Z y el coeficiente de fricción f, que define cómo las moléculas interaccionan con el gel.
Se desarrollan utilizando un soporte gelatinosos que se introduce en el tanque entre un polo positivo y uno negativo. Cuando aplicamos un campo, las proteínas se mueven.
Antes de comenzar se hace un tratamiento con SDS para que las proteínas se separen únicamente en función de su peso. El SDS tiene carga negativa y lo que hace es unirse a las proteínas en función de su masa y hace que todas tengan carga negativa.
La acrilamida y la metilenbisacilamida son compuestos que crean una maya que da lugar a la gelatina. Mediante la adición de polímeros se obtiene el gel que se considera como una malla con poros. La lámina se introduce en un tanque lleno de tampón de recorrido, que favorece la transmisión de corriente. En cada uno de los pocillos inyectamos muestras de prot que avanzan cuando se conecta el circuito. Como en la parte superior está el polo negativo todas van hacia abajo.
Visualmente no podemos determinar que prot hay, cuantas y cómo se sitúan. Por ello se aplica un tampón de muestra colorante, llamado azul de bromofenol. Nos indica cuando acaba la electroforesis. Seguidamente extraemos el gel y lo sometemos a un proceso de tinción con azul de loomesie, compuesto que se une al gel en los puntos en los que hay proteínas. El SDS desnaturaliza las proteínas y cuando analizamos el gel podemos observar 2 proteínas cuando en realidad son dos subunidades. Por ello después de cada cromatografía se ha de hacer una electroforesis y se va analizando que ocurre con el patrón de bandas. En los pocillos se introducen patrones de prot para comparar y así estimar el peso molecular de la misma.
Para saber la masa real de una prot utilizamos una cromatografía de filtración en gel. Una vez que tenemos los patrones medimos las distancias y elaboramos una gráfica con el logaritmo de la masa en función de la migración. Se utiliza una recta de calibrado para el cálculo de masas.
Isoelectroenfoque: Determina el pI de una prot. Consta de un soporte que contiene una mezcla de electrolitos. El cilindro se introduce en un tanque y la separación se hace en base a las cargas y al gradiente de pH del soporte. Las proteínas migrarán hasta un pH que sea igual a su pI.
Electroforesis bidimensional es la suma de las técnicas anteriores. El cilindro con las moléculas ya separadas se somete a una electroforesis para obtener un mapa. Esta técnica se utiliza cuando hay muchísimas prot de las que una buena parte tienen características similares. Separa prot con misma masa molecular pero distinto pI o viceversa.